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目的自身免疫性葡萄膜炎是一类最常见的致盲性眼病。实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)动物模型是研究自身免疫性葡萄膜炎病理机制和探索新型治疗方法的重要工具。此前我们研究发现自体和异体来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能有效预防和治疗R16诱导的大鼠EAU的发生和发展。Exosomes是活细胞分泌至胞外的膜性小囊泡,含有大量与来源细胞功能相关的蛋白质和RNA成分。研究表明,MSCs来源的exosomes在特定动物模型中能下调免疫应答或诱导免疫耐受。本实验研究MSCs来源的exosomes对EAU的局部治疗效果并初步探究其作用机制,进一步优化基于MSC的治疗策略和方案,开发新型有效、适用于临床葡萄膜炎治疗的生物产品。方法1.培养人脐带(human umbilical cord,h UC)来源的MSCs,分离纯化并进行表型鉴定。2.Exosomes的收集:收集生长良好的第3-5代MSCs去除牛血清exosomes的完全培养液,梯度离心获得exosomes,0.22μm过滤后用BCA法测定浓度,存储于-80℃保存备用。3.EAU动物模型制备:光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP)多肽片段R16与含有结核杆菌素H37RA 2.5 g/L的弗氏完全佐剂(Complete Freund’s adjuvant,CFA)等体积混合后充分乳化,每只大鼠用量0.2ml行单后肢足垫皮下注射建立EAU模型。4.Exosomes治疗:36只Lewis大鼠EAU造模后随机分为exosomes治疗组和模型对照组。预实验:治疗组从疾病初发期当日开始每日球旁sub-tenon囊注射不同浓度(10、20、50、100μg)的exosomes,连续注射7天,相应模型对照组注射等体积的PBS缓冲液,最终选取合适浓度进行后续试验。5.临床观察:各组大鼠于免疫后第6天开始每日在裂隙灯显微镜下观察双眼炎症表现,参照Caspi临床分级进行评分。6.视网膜组织病理学观察:Lewis大鼠免疫后第15天及第21天,各组大鼠处死后固定眼球行视网膜组织病理学HE染色,光学显微镜下观察大鼠葡萄膜及视网膜组织结构,参照Caspi病理学分级进行评价。7.视网膜视觉电生理检测:在免疫后第12天、第15天和第21天对各组大鼠进行视网膜视觉电生理检测,纪录a波和b波的振幅。8.流式细胞仪分析T细胞亚群和炎性细胞比例:免疫后第15天处死大鼠,取大鼠眼球和颈部引流淋巴结,制备单细胞悬液,小鼠抗大鼠CD4、白介素(interleukin,IL)-17,干扰素-γ(IFN-γ),叉状头螺旋转录因子3(Foxp3),巨噬细胞标记物(CD68),中性粒细胞标记物(Gr-1),自然杀伤(natural killer cell,NK)细胞标记物(CD161)荧光抗体染色,流式细胞仪分析T细胞亚群,包括CD4~+IL-17~+,CD4~+IFN-γ~+和CD4~+Foxp3~+细胞比例,以及炎性细胞,包括巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞百分比。9.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu)测定T淋巴细胞增殖:免疫后第12天,即发病高峰期,取EAU大鼠脾脏T淋巴细胞。不同浓度梯度(0、1、10、30μg/ml)R16特异性抗原或不同浓度梯度(0、2.5、5、10μg/ml)刀豆蛋白(concanavalin A,Con A)非特异性抗原刺激条件与不同浓度梯度exosomes体外培养48小时,Brdu标记,继续培养24小时,加入Brdu抗体及显色工作液,酶标仪450nm波长处检测吸光度值。10.单核细胞趋化实验:取免疫后第12天大鼠脾脏,分离单个核细胞,体外用Transwell小室系统测定趋化效应,下方孔加入大鼠淋巴细胞趋化因子CCL21以及exosomes,4小时后流式细胞仪分析下孔中迁移的CD4~+T细胞以及炎性细胞的比例。结果1.成功分离培养并鉴定h UC-MSCs。2.成功建立大鼠EAU模型。3.临床观察显示,exosomes治疗可降低EAU病程的临床平均分(P<0.05)。4.视网膜组织病理学改变与临床表现变化一致,exosomes治疗能够减轻炎性细胞浸润和视网膜组织结构的损伤,15天及21天组织病理学评分均显著低于模型对照组。(P<0.05)5.视网膜视觉电生理检测结果显示,exosomes治疗第12天、第15天和第21天检测指标暗适应的a波和b波治疗组振幅均明显高于对照组。6.流式细胞分析结果显示,exosomes治疗可以减少CD4~+IL-17~+,CD4~+IFN-γ~+细胞,NK细胞在眼部淋巴细胞的比例(P<0.05),以及巨噬细胞在眼部吞噬细胞中的比例(P<0.05)。在颈部引流淋巴结中,两组之间各细胞比例未见明显差异。7.Brdu测定T淋巴细胞增殖显示,人脐带来源的exosomes对R16特异性抗原以及Con A非特异性抗原刺激的T淋巴细胞增殖均无明显抑制作用。8.单核细胞趋化实验结果显示,人脐带来源的exosomes可抑制CD4~+T细胞和炎性细胞的迁移趋化能力。结论MSCs来源的exosomes局部注射可以有效治疗EAU,其机制可能与抑制局部炎性细胞的迁移相关。