珍珠龙胆石斑鱼(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂E.lanceolatus)是一种营养丰富、生长速度快且养殖产量高的暖水性海水经济鱼类,主要以鲜活产品形式销售。现有的有水活体流通模式下,存在运输密度低、存活率低、运输后品质劣变及食用安全等问题,无麻醉剂添加的低温休眠无水保活运输是实现高密度、绿色安全的新型活体流通模式。而鱼体在低温、无水应激下的胁迫响应与应答机制研究是保证无水保活运输可行的理论基础。因此本论文以珍珠龙胆石斑鱼(1龄,体重为450-600 g)为研究对象,通过对禁食暂养、低温诱导休眠与无水保活胁迫下鱼体的物质代谢与氧化应激变化探讨了珍珠龙胆石斑鱼低温休眠无水保活的胁迫响应规律;采用TMT差异蛋白组学技术分析了低温休眠与无水保活胁迫下的分子应答机制,主要研究结果如下:(1)珍珠龙胆石斑鱼在水温25℃、盐度23-25‰循环海水中、密度为50 g/L条件下暂养48 h后,可延长有水保活运输时间42%,达到132 h。禁食暂养可显著降低短途运输操作引起的应激反应,血糖与皮质醇水平分别下降62.01%和22.52%;激活肝脏与脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶(CAT)活性,降低体内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量(MDA降低25-30%)。肝脏中糖原分解维持禁食暂养胁迫下的血糖平衡和正常的有氧呼吸。(2)珍珠龙胆石斑鱼生态冰温的极限温度为11℃;采用梯度降温模式降至12-13.5℃时,鱼体呼吸代谢下降,血清转氨酶(谷丙转氨酶ALT和谷草转氨酶AST)活性下降;代谢产物累积,血糖(Glu)和肝脏中乳酸(LD)含量分别增加5.02和1.79倍;鱼体激活碱性磷酸酶(AKP)、抗氧化酶(SOD、GPX、CAT)活性抵抗低温胁迫引起的氧化损伤;Tyr、Phe和Pro是珍珠龙胆石斑鱼低温休眠胁迫下的主要能量来源。因此12-13.5℃可作为珍珠龙胆石斑鱼低温诱导休眠温度。Glu、ALT、碱性磷酸酶(AKP)和脑中MDA水平与温度有显著相关性,可以作为低温诱导休眠过程中的指示指标。(3)低温休眠的珍珠龙胆石斑鱼在低温(15、18℃)下无水存活时间可达到10 h。在15℃无水保活5 h后,血清代谢酶(ALT、AST、ACP、AKP)活性和皮质醇水平无显著变化(p<0.05);糖原分解供能,血糖增加14.32倍,无氧呼吸导致LD累积;肝脏与脑中CAT酶活性显著增强抑制组织MDA的增加。CAT活性水平与无水保活温度及组织中MDA水平呈显著负相关性。因此,低温可以减少无水保活过程中的应激反应,通过代谢适应和抗氧化系统的上调来提高珍珠龙胆石斑鱼无水保活的存活率。(4)珍珠龙胆石斑鱼低温休眠无水保活过程中,低温、无水、温度波动是主要的应激因素,在能量(脂、糖)代谢、氧化应激与肝脏的解毒功能、免疫应答模式、蛋白质与氨基酸代谢及蛋白信号传导中引起鱼体的胁迫应答。(5)低温休眠胁迫下,珍珠龙胆石斑鱼肝脏中PEPCK、LDH、FAS、ACC、AMPK酶活性m RNA表达均显著增加,有水复苏后肝脏与脑组织中糖原含量下降32.28-44.24%。因此,珍珠龙胆石斑鱼在低温与无水胁迫下,主要利用肝糖原与脂肪作为能量物质,在胁迫后期与有水复苏过程中,蛋白质与氨基酸也参与能量代谢。低温胁迫下鱼体通过氨基酸等非糖物质的糖异生作用维持体内血糖稳定,无氧呼吸代谢增加;低温无水胁迫下肝脏糖酵解供能增强;脑中的呼吸代谢下降;25℃有水复苏后机体的糖代谢不能恢复正常水平。(6)低温胁迫下,珍珠龙胆石斑鱼肝脏通过AMPK的去磷酸化调控降低CPT-1和ACAC的表达,抑制FA的氧化分解供能,在FAS、ACC酶作用下合成亚油酸和亚麻酸,由FABP转运到细胞膜上,用于磷脂的合成,抵抗低温胁迫引起细胞膜流动性的改变;在低温无水8 h胁迫后,膜磷脂在PB1的作用下分解,产生的n-3PUFA参与抵抗应激反应引起的能量增加;有水复苏后,FA在ACAC酶作用下分解供能。(7)珍珠龙胆石斑鱼在低温与无水保活应激下,血清皮质醇、组织中ROS水平与CAT酶活性及基因表达水平呈现负相关性,CAT酶活与m RNA表达水平上升,血清皮质醇与组织ROS产生量降低。低温与无水胁迫下AMPK磷酸化调控了m TORC1下游的效应靶蛋白RPS6KB的表达上调,激活CAT与GST酶的作用清除ROS,抵制脂质过氧化的应激损伤。有水复苏应激后,机体的抗氧化酶作用不能完全抵制氧化应激引起的组织损伤,导致生存能力的下降。