研究背景:多重耐药细菌感染的发病率急剧上升,对人类健康构成了严重挑战,创面多重耐药细菌感染会不仅加重创面恶化,愈合延迟,甚至导致脓毒症最终死亡。因此,迫切需要研发新的治疗方法来替代传统抗生素的应用,这也是目前生物医学领域亟待解决的问题。光热疗法和光动力疗法分别是利用光热效应和光动力效应进行诊断和治疗疾病的一种新方法。光动力疗法中当光敏剂吸收一定波长的激光之后将能量传递给周围的氧气,产生活性氧,从而杀死肿瘤或细菌。但目前光动力疗法存在光源穿透深度较弱、感染部位乏氧等瓶颈。光热疗法利用具有较高光热转换效率的材料,并在外部光源的照射下将光能转化为热能,杀死肿瘤或细菌。当单独使用时,通常所需的辐照强度会高于皮肤承受温度,由此导致的局部高温可能会对附近的健康组织造成严重损害。烷自由基是高分子聚合中常见的自由基,发挥作用不需要氧气的存在,可以用于细菌的杀灭。石墨烯是由碳原子构成的一类二维片层结构,具有较大的比表面积、良好的机械性能和优异的导电导热性能,石墨烯衍生物具有良好的生物相容性。多巴胺能在弱碱性条件下通过氧化自聚形成聚多巴胺粘附在多种材料的表面,是非常有效的光敏剂和光热剂,具有效果显著的光吸收性能。壳聚糖经过乙二醇修饰后具有良好的生物相容性,同时在安全性和微生物降解性等方面也表现优良,并且兼具不同pH条件下电荷反转特性,能够与带负电荷的细菌靶向结合。本课题中我们设计制备了一种基于装载自由基引发剂的光热诱导靶向石墨烯纳米抗菌材料,研究了研制过程中的表征特点,在不同氧分压下研究了纳米材料体外体内靶向作用细菌能力、烷自由基抗菌性能、抗菌机制、生物相容性以及对皮肤多重耐药细菌感染创面愈合的影响及其机制。不仅为多重耐药细菌的消融提供了一种新的氧独立策略,而且揭示了各种自由基在生物医学应用中的潜力,对未来研制基于装载自由基引发剂的光热诱导靶向石墨烯新型抗菌敷料或抗菌涂层提供了详实的实验基础,也为皮肤感染创面的治疗提供了新的思路和方法。目的:本研究拟以聚多巴胺包覆的羧基化石墨烯为原料,交联pH敏感的乙二醇壳聚糖分子,通过装载自由基引发剂,制备光热诱导靶向石墨烯纳米抗菌材料（AIBI-GCS-PDA@CG）,建立一种基于光热诱导产生烷自由基的靶向多重耐药细菌治疗新策略。通过对光热诱导靶向石墨烯纳米抗菌材料功能特性进行分析,探究其在靶向细菌、抗菌能力、抗菌机制、生物安全性及对皮肤感染创面愈合的影响,为多重耐药菌感染的治疗提供新的治疗方向和策略。方法:1 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料的研制及表征研究:1.1 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料的研制:以羧基化石墨烯为基材,表面包覆聚多巴胺涂层,交联pH敏感的乙二醇壳聚糖分子,通过非共价键结合装载自由基引发剂AIBI,制备纳米抗菌材料AIBI-GCS-PDA@CG。1.2 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料表征研究:采用纳米粒度仪对纳米材料粒径大小、表面电荷进行测量;采用近红外光仪、热成像仪对纳米材料光热性能进行检测;采用透射电子显微镜、原子力显微镜对纳米材料形貌及厚度进行分析;采用傅里叶变换红外光谱仪对纳米材料红外吸收光谱进行表征;采用紫外可见光分光光度计对纳米材料紫外-可见光吸收光谱进行检测;采用热重分析仪对纳米材料组分进行分析;采用拉曼光谱仪表征纳米材料的拉曼吸收光谱。2 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料的靶向细菌作用研究:2.1 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料在体外与细菌靶向结合作用:通过在酸性环境（pH 6.3）和生理环境（pH 7.4）下,体外观察纳米材料与细菌靶向沉降能力;纳米粒度仪分别检测细菌以及纳米材料与细菌靶向结合后的表面电荷情况;扫描电子显微镜检测纳米材料与细菌特异性靶向结合情况、与3T3成纤维细胞结合情况。2.2 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料在体内向感染部位靶向聚集作用:采用紫外可见光分光光度计检测荧光染料与纳米材料结合后的稳定性;采用活体动物成像系统检验体内条件下纳米材料对细菌感染部位的靶向性;采用热成像仪进一步对体内条件下纳米材料细菌感染部位的光热效应与靶向性进行研究。3 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料的光热诱导靶向抗菌作用研究:3.1 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料的体外光热诱导靶向抗菌作用:采用标准平板计数法检测纳米材料体外靶向抗菌能力。3.2 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料的体内光热诱导靶向抗菌作用:建立小鼠MRSA皮下脓肿模型,尾静脉注射AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料后观察纳米材料光热诱导靶向抗菌效果,并对脓肿组织进行菌落计数定量分析;H&E染色分析脓肿部位组织愈合情况。4 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料抗菌作用的机制研究:4.1 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料产生烷自由基的检测:采用电子自旋共振技术检测纳米材料烷自由基生成;采用电子自旋共振技术检测纳米材料与细菌结合后烷自由基的生成;采用电子自旋共振技术检测纳米材料在正常氧气及无氧条件下烷自由基的治疗机制。4.2 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料所产生自由基的分子生物学作用:在正常氧气及无氧条件下活性氧水平检测、谷胱甘肽水平检测以及DNA损伤检测,探究烷自由基导致细菌氧化应激反应的分子生物学作用。5 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料生物安全性研究:5.1 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料对3T3成纤维细胞增殖的影响:纳米材料与3T3成纤维细胞共培养24小时后,通过CCK-8法检测3T3成纤维细胞的增殖情况。5.2 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料血液相容性研究:通过溶血实验检测纳米材料血液相容性。5.3 AIBI-GCS-PDA@CG在体安全性检测:将纳米材料经小鼠尾静脉注射后1天及30天,观察小鼠各主要脏器、血液系统是否出现病理性损伤变化,探究其急性和慢性毒性作用。结果:1 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料的研制及表征研究:1.1 AIBI-GCS-PDA@CG超声2小时后37.38%的纳米材料粒径大小为712 nm,超声6小时后39.13%的纳米材料粒径大小为459 nm,超声10小时后32.18%的纳米材料粒径大小为220 nm。1.2 AIBI-GCS-PDA@CG在808 nm NIR 0.5W/cm²和0.75W/cm²功率照射下,7 min时到达平台期,光热效应具有时间依赖性及浓度依赖性,能有效地将光能转换为热能,光热转换效率为41.96%。1.3连续循环5次808 nm NIR照射后AIBI-GCS-PDA@CG悬浮液的吸光度（808 nm）损失低于5%,具有显著的光热稳定性。AIBI-GCS-PDA@CG在含血清的培养基中静置0-7 day,水合粒径仅出现细微的变化,血清介质中具有显著的的稳定性。1.4 TEM显示AIBI-GCS-PDA@CG片层表面光滑透明,存在皱褶,AFM显示AIBI-GCS-PDA@CG为单片层,表面稍粗糙,厚度～2.1 nm。1.5纳米粒度仪显示在pH 5.0-7.0之间,AIBI-GCS-PDA@CG表面带正电荷,在pH 7.4时带有负电荷。1.6 FTIR-ATR表明AIBI-GCS-PDA@CG中均出现CG、PDA、GCS及AIBI特征吸收峰。1.7紫外-可见光吸收光谱提示AIBI-GCS-PDA@CG在808 nm处吸收峰值显著增加。1.8 TGA提示AIBI-GCS-PDA@CG中AIBI装载量为5.84%。1.9拉曼光谱提示AIBI-GCS-PDA@CG中石墨烯G峰在1580cm^-1附近,D峰在1350 cm^-1附近。2 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料的靶向抗菌作用研究:2.1体外条件下AIBI-GCS-PDA@CG与细菌混合后（pH 7.4）溶液处于浑浊状态,未发生聚集沉淀。而在pH 6.3条件下,混合物在30 min内迅速聚集并沉淀到管底。2.2 Zeta电位显示,pH敏感的AIBI-GCS-PDA@CG在酸性环境（pH 6.3）下表现为表面净正电荷,与带负电荷的细菌产生强烈的静电相互作用,使其表面电荷由负电荷向正电荷转化。2.3在扫描电镜下可以观察,细菌（S.aureua、MRSA）在酸性条件下与GCS-PDA@CG和AIBI-GCS-PDA@CG紧密结合,在中性条件下与未发现GCS-PDA@CG和AIBI-GCS-PDA@CG的存在。AIBI-GCS-PDA@CG纳米薄片在pH7.4时暴露于3T3成纤维细胞中,未观察到样品细胞与石墨烯纳米材料结合。2.5荧光光谱及光谱强度表明荧光分子（CY5）能通过共价键结合在纳米复合材料上,在至少24 h时间范围内不能与复合物解离,证明f-AIBI-GCS-PDA@CG可以在体内有效的发挥成像作用。2.6活体动物成像系统显示AIBI-GCS-PDA@CG在体内注射2小时后靶向富集到脓肿部位,6小时荧光达到最大值,24小时后逐渐减少。注射后24小时的体外荧光图像进一步显示,AIBI-GCS-PDA@CG在脓肿和肝脏等代谢器官中富集。2.7热成像图进一步表明AIBI-GCS-PDA@CG具有良好的体内靶向性,纳米材料在体内皮肤感染部位具有显著的光热转换能力。3 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料的光热诱导靶向抗菌作用研究:3.1标准平板计数法显示AIBI-GCS-PDA@CG在光热作用条件下有抗菌作用。3.2体内动物实验显示,AIBI-GCS-PDA@CG抗菌率达到99%,H&E染色提示脓肿创面基本愈合,在治疗多重耐药细菌感染导致的皮下脓肿中效果非常显著。4 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料抗菌作用的机制研究:4.1 ESR分析显示AIBI-GCS-PDA@CG在808 nm NIR条件下可以产生烷自由基,波谱强度随照射时间延长而增强。4.2 ESR分析显示AIBI-GCS-PDA@CG与细菌结合后在808 nm NIR条件下烷自由基的波谱强度变低,证明烷自由基发挥作用。4.3正常氧气及无氧条件ESR显示烷自由基的生成是氧独立的,在有氧条件下,由于其高反应性,烷自由基很容易与氧气反应变为烷氧自由基,在无氧条件下,烷自由基自身发挥作用。4.4正常氧气条件下AIBI-GCS-PDA@CG产生的烷自由基转变为烷氧自由基可直接导致细菌ROS水平升高,无氧条件下烷自由基通过累积效应导致细菌氧化应激反应,最终导致细菌死亡。4.5 AIBI-GCS-PDA@CG分解生成的烷自由基在正常氧气和无氧条件下均能有效地裂解DNA链,表明AIBI-GCS-PDA@CG在细菌中具有较高的DNA损伤活性。5 AIBI-GCS-PDA@CG纳米抗菌材料生物安全性研究:5.1 CCK-8试验显示AIBI-GCS-PDA@CG浓度低于1.0 mg/mL时对3T3成纤维细胞具有可以忽略的毒性。5.2当AIBI-GCS-PDA@CG浓度为0.1 mg/mL-1.0 mg/mL时,溶血率均小于5%,表明AIBI-GCS-PDA@CG对红细胞无损伤,具有良好的血液相容性。5.3将0.20 mg/mL和0.50 mg/mL浓度的AIBI-GCS-PDA@CG经小鼠尾静脉注射注射1天及30天之后,未见各主要脏器明显的病理变化,表明其良好的体内生物相容性。30天后小检查小鼠的血常规、肝功能、肾功能等,均无明显慢性毒性作用,进一步证明AIBI-GCS-PDA@CG良好的生物安全性。结论:本课题提出了一种新的基于烷自由基的光热诱导靶向多重耐药细菌治疗策略,成功研制了光热诱导靶向石墨烯纳米抗菌材料AIBI-GCS-PDA@CG。该纳米抗菌材料通过在近红外光条件下产生烷自由基而发挥抗菌作用,并对动物皮肤多重耐药细菌感染具有显著的治疗作用。同时发现,AIBI-GCS-PDA@CG在正常氧和无氧条件下均具有同等的治疗效果,但其作用机制各不相同。在常氧条件下,生成的烷基自由基经氧气转化为烷氧自由基,直接对细菌造成损伤。在无氧条件下烷自由基通过累积效应导致细菌氧化应激反应。烷自由基和烷氧自由基均可表现出DNA损伤活性,最终导致细菌死亡。本方法为在更复杂条件下光热疗法的应用提供了更加的选择,并可成为一种有效的抗生素替代疗法,为多重耐药细菌的皮肤感染提供新的治疗方向和策略,并有利于进一步探索用于多重耐药细菌治疗新的多功能纳米平台。