【摘 要】
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目的:大量研究表明,半导体激光可以有效杀灭根管内存在的粪肠球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis),然而,目前关于半导体激光对粪肠球菌的杀灭机理研究较少。本研究通过菌落平板计数法和扫描电子显微镜(SEM)评估半导体激光的灭菌效果;采用微生物粘附碳氢化合物法(MATH)测试粪肠球菌生物膜细胞表面疏水性百分比;其中蒽酮法用于测定粪肠球菌中水溶性胞外多糖(WSE)和水不溶
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目的:大量研究表明,半导体激光可以有效杀灭根管内存在的粪肠球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis),然而,目前关于半导体激光对粪肠球菌的杀灭机理研究较少。本研究通过菌落平板计数法和扫描电子显微镜(SEM)评估半导体激光的灭菌效果;采用微生物粘附碳氢化合物法(MATH)测试粪肠球菌生物膜细胞表面疏水性百分比;其中蒽酮法用于测定粪肠球菌中水溶性胞外多糖(WSE)和水不溶性胞外多糖(WIE)的量;激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)评估粪肠球菌生物膜细胞外多糖的分布;与粪肠球菌生物膜形成及粘附相关的基因(如gel E,ace和esp)的表达水平则通过实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR)来评估。通过上述实验,探讨半导体激光(810nm)对粪肠球菌生物膜形成和粘附的影响。方法:1.平板菌落计数法评估半导体激光的灭菌效果建立粪肠球菌生物膜模型,并将其分为3组。连续培养48h后,每天2次处理生物膜,其中:(1)使用28.7J/cm~2能量密度的半导体激光(810nm);(2)1%次氯酸钠(Na OCl)作为阳性对照组;(3)0.9%生理盐水(Na Cl)作为阴性对照。各组处理完成后逐级稀释,进行平板菌落计数确定各组活菌数量。2.扫描电子显微镜(SEM)观察半导体激光的灭菌效果将取得的各组粪肠球菌生物膜玻片样本加入乙醇逐步进行梯度脱水,随后通过离子溅射仪在真空中在粪肠球菌生物膜玻片样本上喷金,然后在扫描电子显微镜(SEM)下观察。3.粪肠球菌生物膜细胞的疏水性百分比测定将获得的各组粪肠球菌生物膜样本采用微生物粘附碳氢化合物法(MATH)测试粪肠球菌生物膜细胞表面疏水性百分比。4.粪肠球菌生物膜细胞的胞外多糖(WSE与WIE)测定4.1使用无菌水收集处理后的粪肠球菌生物膜样本,每管中生物膜细胞所生成的水溶性胞外多糖(WSE)以及水不溶性胞外多糖(WIE)的含量用蒽酮法测定。4.2将各组处理后样本进行胞外多糖荧光染色,各组挑选3个样本置于激光共聚焦显微镜观察,进行图像信息采集及处理,观察粪肠球菌生物膜胞外多糖结构。5.粪肠球菌生物膜粘附与形成相关基因表达水平的测定使用q PCR检测半导体激光对粪肠球菌生物膜粘附及形成相关基因gel E、ace和esp的影响结果:1.平板菌落计数法评估半导体激光的灭菌效果:与Na Cl阴性对照组相比,激光照射组粪肠球菌生物膜显示出菌落数量减少,差异有统计学意义(p<0.05)。与Na OCl阳性对照组相比,激光照射组灭菌效果优于Na OCl组,且差异具有统计学意义(p<0.05)。2.扫描电子显微镜(SEM)观察半导体激光的灭菌效果Na Cl组粪肠球菌生物膜结构完整,细菌粘附成团且数量较多;激光照射组及Na OCl组粪肠球菌生物膜结构破坏,细菌散在分布且数量显著下降,残留细菌形态显示异常。3.粪肠球菌生物膜细胞的疏水性百分比测定其中与Na Cl组相比,激光照射组粪肠球菌生物膜疏水性百分比下降,该差异有统计学意义(p<0.05);Na OCl阳性对照组粪肠球菌生物膜疏水性百分比与Na Cl组相比,差异不显著(p>0.05)。4.粪肠球菌生物膜细胞的胞外多糖(WSE与WIE)测定结果4.1蒽酮法测定结果:与Na Cl组相比,半导体激光照射组粪肠球菌生物膜细胞外多糖的含量下降,差异有统计学意义(p<0.05);与Na OCl组相比,激光照射组粪肠球菌生物膜细胞外多糖的含量相差不大,差异没有统计学意义(p>0.05)。4.2激光共聚焦图像处理结果:Na Cl组图像中可见大面积绿色荧光,而红色荧光较少,说明该区域活菌数较多,且胞外多糖合成活跃。激光照射组及Na OCl组图像中可见大范围红色荧光及绿色荧光,说明样本中死菌数量增多,而胞外多糖的量相对减少。5.粪肠球菌生物膜细胞的q PCR检测结果与Na Cl组相比,激光组gel E、ace和esp基因表达相对量下降,差异有统计学意义(p<0.05)。与Na OCl组相比,激光组gel E、ace和esp基因表达相对量下降,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:半导体激光(810 nm)可降低粪肠球菌生物膜细菌活力,其中相较于Na OCl,激光灭菌效果更好;半导体激光(810 nm)激光可通过降低粪肠球菌表面的疏水性、减少粪肠球菌生物膜WIE和WSE的合成,从而抑制粪肠球菌生物膜的粘附作用;半导体激光(810 nm)可通过抑制对粪肠球菌生物膜相关基因gel E、ace和esp的表达而减少粪肠球菌生物膜的形成并抑制其黏附。
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