定点突变技术是研究蛋白质结构和功能关系的高效工具，是目前生物学、医学等领域研究中的一种有效实验手段。采用定点突变法对蛋白质进行理性设计是改善酶性能及功能的有效方法，可应用于改变酶的底物专一性、对映选择性、pH/温度稳定性、对有机溶剂的耐受性等。本实验以重组了谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶panD基因的大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET24a(+)-panD作为研究对象，探索定点突变技术对L-天冬氨酸α-脱羧酶(ADC)性能改造的可能性。ADC可专一催化L型天冬氨酸脱去α-羧基生成β-丙氨酸，可用于拆分D,L-天冬氨酸和生产β-丙氨酸。β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，是合成维生素B5补充剂泛酸钙、抗氧化剂肌肽、延缓骨溶药物博宁等药物及其他中间体的重要原料，也是近年来市场商业化的氨基酸体能补充剂。目前，化学合成仍是生产β-丙氨酸的主要方法，存在原料成本高、产生腈类三废、工艺条件苛刻、副产物多纯化难等问题。酶转化催化在改善工艺、降低成本、提高产品质量和安全、减少对环境和健康的影响方面有潜在优势。对L-天冬氨酸α-脱羧酶催化性能改造的研究有利于推动β-丙氨酸绿色合成工艺的早日实现。首先，分析了原酶ADC的酶学性质、抑制动力学。ADC的最适反应温度为55℃，最适pH为6.0，在低于37℃时和偏酸pH4.07.0的范围内保持较好的稳定性。以L-天冬氨酸为底物测定动力学参数过程中，该酶出现底物抑制现象，实验测得Km值为73.7μmol·L-1，KI值为11.0mmol·L-1。ADC催化L-天冬氨酸脱去α-羧基，生成二氧化碳和β-丙氨酸，在催化过程中随着二氧化碳的挥发，体系中的pH缓慢上升。如果反应体系的初始pH为6.0，在催化5g·L-1的天冬氨酸完全转为β-丙氨酸后体系pH将达到7.2。ADC的酶活对pH较敏感，在偏碱pH环境中酶活损失明显；底物抑制情况及反应过程中酶活的逐渐损失也限制了这个酶的生产应用。然后，对ADC进行氨基酸定点突变实验以改善酶性能，根据已发表的ADC蛋白三维结构及氨基酸序列同源性分析确定突变氨基酸位点，结合二十种氨基酸的理化性质及Discovery Studio软件虚拟突变的结果进行突变设计。从与底物结合及催化相关的氨基酸中选择拟突变氨基酸，确定突变子Lys9Ser、Lys9Arg、Ile86Trp；根据非活性位点个别氨基酸错义突变方法，确定突变子Ile5Met、Asp19Asn；根据loop区氨基酸缺失突变方法，确定了缺失突变子ΔGly65。最后，对突变效果进行对比分析。非催化位点突变I5M、催化位点突变K9S及loop区缺失突变ΔG65丧失了酶活性，说明无论是催化位点还是非催化位点均会对蛋白质构象和功能起到作用；催化结合位点突变I86W和非催化位点突变D19N对酶性能改变并不大，说明有些单点突变可能对蛋白质在构象和功能无较大影响，蛋白质在结构上有一定自稳范围；催化位点突变K9R改变了酶功能，说明催化位点的重要改变可能会影响酶与底物相互作用的关系，对酶新功能的开发有启示意义。