第一部分Slit2在胰腺癌迁移和神经侵袭中作用研究　　研究背景：胰腺癌是实体肿瘤中致死率最高的肿瘤之一;主要通过神经、血管和淋巴等侵袭途径进行远处转移;极大地限制了胰腺癌患者的生存率。疼痛是胰腺癌患者最常见的临床症状;而神经侵袭是导致胰腺癌患者疼痛的主要原因之一。在胰腺癌患者中;神经侵袭的发生率高达84-100%。是胰腺癌的典型组织病理学特征;与患者手术效果不佳;术后复发率高密切相关。因此;针对胰腺癌特有的神经侵袭特性;探询神经侵袭调控的关键因子;对于胰腺癌的诊断和治疗都具有重要意义。在神经和血管中;神经导向分子Slit2及其受体蛋白Robo1参与了神经和上皮细胞的生长调控;同时也在众多肿瘤中抑制细胞的转移。因而;Slit2可能是参与胰腺癌转移和生长的关键因子。在本课题组的前期研究结果中已经证明Myo9b能够参与Slit2/Robo1信号通路对肺癌细胞转移的影响。但是目前缺乏关于胰腺癌中Myo9b的功能和机制研究。本论文旨在证明Myo9b参与胰腺癌细胞的功能和机制的调控;且其受到Slit2的影响;为胰腺癌的机制研究提出了新的方向。　　由于目前研究神经侵袭的主要方法包括动物实验和在体外基质中进行肿瘤细胞和神经的共培养。但是前者耗时长;后者体外培养的细胞外基质对肿瘤细胞的迁移具有一定神经导向性;且二种方法均不适合于高通量筛选调控神经侵袭的关键因子。微流控技术具有样品用量少;可控性好;高通量等优点;近年来发展迅速;为我们的进行神经侵袭的研究提供了新的思路。　　研究目的：　　1. 建立分析肿瘤细胞与神经相互作用的新型微流控小室;体外培养检测高侵袭肿瘤细胞与神经相互作用的特征;　　2. 在微流控小室中检测Slit2/Robo1/Myo9b对胰腺癌细胞与肿瘤之间相互作用的影响;检测Slit2/Myo9b对胰腺癌迁移的影响及其机制;体内实验验证Slit2参与调控胰腺癌的神经侵袭。　　研究思路：　　1. 设计和制备PDMS四通道微流控小室;利用不同的活细胞染料分别对肿瘤细胞和神经进行染色;检测高侵袭性的胰腺癌和前列腺癌细胞在该系统中与神经相互作用的特征;同时分析已报道的能阻断神经侵袭的GDNFα1抗体在该系统中使用的有效性;验证微流控小室的可行性;　　2. 利用生物信息学分析Slit2和Robo1在胰腺癌组织中的表达和突变情况;构建稳定表达Slit2的胰腺癌细胞株;检测Slit2在微流控小室中对胰腺癌细胞与神经之间作用特征的影响;包括肿瘤细胞与神经的相互作用指数;迁移速度;运动轨迹等;通过加入Robo1的胞外段分泌蛋白RoboN的条件培养基;检测Slit2调控肿瘤神经相互作用依赖于Robo1;利用Wound healing 和Transwell试验检测Slit2/Robo1对胰腺癌细胞迁移的影响;GST Pulldown和western-blot分析Slit2/Robo1对RhoA活性的调控;　　3. 构建胰腺癌神经侵袭小鼠模型;检测Slit2对小鼠模型行为能力的影响;同时对肿瘤神经侵袭组织块进行免疫组化、H&E染色和电镜分析;　　4. 利用生物信息学分析Myo9b和RhoA在胰腺癌组织中的表达和突变情况;构建条件性敲低Myo9b的胰腺癌稳定细胞株;在微流控小室中检测Myo9b对胰腺癌细胞与神经之间的相互作用的影响。Wound healing 和Transwell试验检测Myo9b对胰腺癌细胞迁移的影响;GST Pulldown和western-blot分析Myo9b对RhoA活性的调控;在Slit2过表达的胰腺癌细胞株中干扰Myo9b后;检测其对胰腺癌细胞迁移和RhoA活性的影响;在Myo9b低表达的细胞中;检测过表达RhoGAP结构域及其活性位点突变体（R1735M）对胰腺癌细胞迁移和RhoA活性的影响。　　研究结果：　　1. 成功构建应用于神经和肿瘤相互作用分析的新型微流控小室;　　2. 体外实验证明Slit2/Robo1能够抑制胰腺癌细胞与神经之间的相互作用;同时上调RhoA的活性;抑制胰腺癌细胞的迁移;　　3. 体内证明Slit2抑制胰腺癌肿瘤的形成;肿瘤的神经侵袭;干扰小鼠的后肢行为能力;　　4. 体外实验证明Myo9b低表达可以减弱胰腺癌细胞与神经之间的相互作用;同时证明Slit2调控细胞迁移依赖于Myo9b对RhoA活性的影响。　　第二部分 Bcr-Abl定位改变对白血病细胞的影响　　研究背景：Bcr-Abl是慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia; CML）的特征性蛋白;目前治疗的关键药物酪氨酸激酶抑制剂耐药性高达1/3。与Bcr-Abl结构相似的c-Abl蛋白在细胞浆和细胞核自由穿梭;其中胞核c-Abl的积累能够促进p73磷酸化;诱导细胞凋亡。而Bcr-Abl 却只能在细胞浆中;募集 Grb2 ;刺激细胞增殖信号;如Akt/Stat5/ERK等;从而导致CML细胞的恶性增殖。　　研究目的：转运CML细胞株中的Bcr-Abl入核;抑制CML细胞增殖;促进CML细胞凋亡。为CML患者;尤其是TKI耐药病人的治疗提供了新的思路。　　研究思路：　　1. 利用腺病毒的高感染率;构建 FKBP-雷帕霉素类似物(AP21967)-FRB 核转运系统（ Rapamycin analogue mediated neucler Transport System; RNTS）： FKBP与SH2结构域（特异性与Bcr-Abl蛋白结合）融合;FRB与核定位信号（nuclear location singnal;NLS）形成融合蛋白;在AP21967作用下; FKBP和FRB结合;进而实现NLS传递给Bcr-Abl;　　2. 免疫荧光和western-blot检测RNTS对CML细胞株（包括TKI耐药株）Bcr-Abl定位的改变;MTT和克隆形成实试验检测定位改变的Bcr-Abl对CML细胞增殖的影响;FCM检测定位改变的Bcr-Abl对CML细胞凋亡的影响;　　3. western-blot检测定位改变的Bcr-Abl对细胞增殖和凋亡信号相关蛋白的影响。　　研究结果：　　1. 成功构建FKBP-AP21967-FRB核转运系统;　　2. RNTS成功转运Bcr-Abl进入细胞核;抑制CML细胞的增殖;促进CML细胞的凋亡;　　3. RNTS转运Bcr-Abl入核抑制细胞的增殖信号Akt/Stat5/ERK;促进p73的磷酸化及下游信号的激活;促进CML细胞凋亡。