敦煌盐碱土中产胞外多糖菌株的筛选鉴定及多糖活性的研究

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细菌胞外多糖作为细菌代谢产生的一类活性物质,具有生长周期短、产量高、理化性质独特等优势,因此成为目前资源微生物领域研究的热点之一。产胞外多糖的微生物种类繁多,但是现已投入工业化生产的胞外多糖屈指可数,因此开发具有应用价值的新型微生物胞外多糖是目前亟待解决的问题。由于极端环境下微生物所产胞外多糖更具功能、类群多样性,因此河西走廊可作为产具有应用价值的胞外多糖微生物的潜在菌源地进行进一步探究。本实验室从敦煌盐碱土中分离筛选得到一株高产胞外多糖菌株,确定了其最佳培养基组分,并对其胞外多糖进行了提取纯化和活性初步探究,以期能够开发出投入工业化生产的胞外多糖。主要研究内容及结果如下:(1)本研究采用稀释涂布平板法从敦煌盐碱土分离得到18株产胞外多糖菌株,通过苯酚硫酸法筛选得到一株高产胞外多糖菌株Ⅱ4-01,结合生理生化特征、形态学特征和16S rDNA分子生物学鉴定方法,将其鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis);(2)结合单因素试验和正交试验对地衣芽孢杆菌Ⅱ4-01产糖条件进行了初探,结果表明,菌株Ⅱ4-01优化后培养基配方为:25 g/L蔗糖,25 g/L黄豆粉,0.5 g/LMgSO4,2 g/LNa2HPO4·12H2O,1 g/LNaH2PO4·2H2O,pH为7.5。优化后,菌株Ⅱ4-01在培养36 h时,胞外多糖产量最高,达8.594 g/L,较优化前产量提高了10.16倍;(3)利用醇沉法、Sevag法和透析法等方法,对菌株Ⅱ4-01胞外多糖进行提取和纯化,后续将纯多糖样品进行紫外和红外检测。紫外检测结果显示,该纯多糖在260 nm和280 nm处没有出现特征吸收峰,可排除蛋白质和核酸的影响,初步认为该产物的主要成分为多糖;红外图谱显示,该多糖伸缩振动峰符合糖类的特征峰,进一步证明该提取物为多糖类物质;(4)地衣芽孢杆菌Ⅱ4-01胞外多糖的抗氧化活性测定结果表明,其所产胞外多糖对DPPH·自由基、·OH自由基和H2O2都具有一定的清除能力,其中对·OH自由基的清除能力最强;粗多糖质量浓度为8 mg/mL时,清除率高达90.42%,纯多糖浓度为8 mg/mL时,清除率达61.55%,因此该胞外多糖具有开发成天然抗氧化剂的潜力。(5)采用干燥器控制湿度的方法测定多糖的吸湿保湿活性,结果表明,当湿度条件分别为43%和81%时,纯多糖均表现出较强的吸湿能力;湿度为43%时,吸湿能力表现为:纯多糖>黄原胶>粗多糖>壳聚糖,湿度为81%时,吸湿能力表现为:纯多糖>粗多糖>黄原胶>壳聚糖。在饱和Na2CO3和干硅胶环境下,纯多糖均表现出显著的保湿能力,在饱和Na2CO3环境下,纯多糖的保湿能力与壳聚糖、粗多糖相比优势不具显著性,在干硅胶环境下,纯多糖的保湿活性显著优于壳聚糖、黄原胶和粗多糖,因此将纯多糖开发为天然保湿剂具有商业化应用可行性;(6)菌株Ⅱ4-01发酵液、所产胞外多糖对高岭土和黄河水的絮凝活性测定结果表明,其发酵液对高岭土的絮凝活性较强,可达74.72%,粗多糖和纯多糖对高岭土的絮凝率分别为16.07%和19.42%;对黄河水的絮凝结果显示,其发酵液、粗多糖和纯多糖的絮凝活性分别为24.05%、26.17%、28.99%,说明所产胞外多糖的絮凝效果不显著。
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