论文部分内容阅读
微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是近年来发现的一种新型基因转录后调控小分子,大小约19--23个碱基,miRNA特异性地结合到靶标mRNA的3’非翻译区,在转录后水平调控基因表达,对靶基因的调控呈负调控。越来越多研究表明,miRNA的异常表达在各种疾病的发生发展扮演着重要的角色。它不仅能在组织中调控疾病相关信号通路中的关键基因；也能够通过微囊泡(microvesicles, MVs)的传递作为信号分子调节细胞之间的相互作用；并且血清中稳定存在的miRNA可以作为预测、诊断疾病发生的生物标志物。本论文主要从以上这三个方面,探讨miRNA在疾病中的功能与应用研究。首先我们研究血小板来源的miRNA通过MV介质传递并影响内皮细胞功能的机制。我们发现人的血小板细胞中富含数量巨大的miRNA前体和成熟体,在炎症因子的刺激下,血小板中的miRNA前体可以转化为成熟体,其中以miR-223的基础含量最高,变化倍数最为显著。同时,刺激后的血小板释放出大量包裹有miR-223的MV。这些MV能够进入血管内皮细胞HUVEC中,并且将miR-223导入HUVEC细胞中。血小板来源的miR-223能够降低HUVEC细胞中胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)的表达,进而促进HUVEC在糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)诱导下引起的凋亡。其次我们开展了血清中人类巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)编码的miRNA-US4-1作为预测干扰素a(interferon a, IFNa)治疗慢性乙型病毒性肝炎病人疗效的生物标志物的临床研究。我们收集了56例干扰素治疗前的乙肝病人血清,并通过跟踪其治疗后的血液生化指标将其分为有效组和无效组。用定量实时荧光定量PCR(TaqMan探针)对20例样本(有效组、无效组各10人)进行逐个检测,初筛出5种稳定的表达差异显著的HCMV miRNA;接着对另外36例样本(有效组、无效组各18人)进行复筛,进一步筛选出有显著差异的2种HCMV miRNA,并用对干扰素疗效预测的ROC曲线下面积达1.00的miR-US4-1进行双盲实验,进行双盲实验,通过检测hcmv-mir-US4-1在96例干扰素α疗效未知的乙肝病人血清中的表达量,判断干扰素治疗乙肝的疗效并验证其正确率,发现在有效组和无效组正确率分别达到84%和72%。我们的实验结果表明血清中HCMV编码的miRNA-US4-1可以作为预测IFNa治疗慢性乙肝疗效的生物标志物。最后,我们研究了成熟miRNA的作用方式及其对癌症进程的影响。我们首先研究了miR-200b和miR-200c促进大肠癌增殖的作用方式和机制,荧光实时定量PCR检测发现miR-200b/c在大肠癌组织中显著升高。生物信息学预测显示,回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元RECK是miR-200b/c的靶基因,并且在大肠癌组织中表达下调。荧光素酶报告基因实验证明miR-200b/c可与RECK mRNA的3’-UTR结合。在大肠癌细胞系中过表达或抑制miR-200b/200,可相应降低或升高RECK蛋白水平,导致RECK/SKP2/p27Kip1信号通路的变化,最终影响大肠癌细胞增殖能力。RECK过表达质粒缺少3’-UTR,因此其表达不受miRNA调节,可回复miR-200b/c对RECK的抑制作用,解除miR-200b/c对上述信号通路的影响和对大肠癌细胞增殖能力的影响。最后通过小鼠植瘤模型进一步证实了,miR-200b/c可以通过调节RECK蛋白的表达从而调控大肠癌细胞的增殖和植瘤的体积大小以及恶性程度。而恢复RECK蛋白的表达可以显著降低肿瘤细胞的增殖能力、肿瘤的体积大小以及恶性程度,该实验结果为大肠癌的治疗提供了全新的思路。另外,我们还研究了miR-221促进乳腺癌迁移的作用方式和机制。通过比较我们发现恶性程度较高的乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞内E-钙黏素(E-cadherin,E-cad)蛋白表达明显低于恶性程度较低的乳腺癌细胞系MCF-7。但转染到MDA-MB-231细胞中的E-cadherin过表达质粒可以转录出的E-cadherin mRNA却不能翻译出E-cadherin蛋白,向MCF-7细胞中转染E-cadherin过表达质粒可以表达出E-cadherin蛋白。结合过表达质粒的结构特征以及本课题组长期miRNA研究经验,我们推测在乳腺癌细胞内存在一种"miRNA/E-cad ORF"新调控机制。通过生物信息学预测我们筛选出了可能与E-cad ORF结合的8种miRNA。通过荧光实时定量PCR检测发现miR-221在乳腺癌组织、恶性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和TGF-β诱导处理促恶化后的MCF-7细胞中均发生显著上调。荧光素酶报告基因实验证明miR-221可与E-cadherin mRNA的ORF结合。在MCF-7细胞中过表达miR-221或在MDA-MB-231细胞中抑制miR-221,可相应降低或升高E-cadherin蛋白水平,在MDA-MB-231细胞中转染E-cadherin突变质粒(miR-221结合位点进行同义突变)或者共转染E-cadherin野生型质粒和miR-221抑制剂(anti-miR-221)后也可以提高E-cadherin蛋白水平,最终影响乳腺癌的迁移、侵袭能力。进一步研究发现,E-cadherin的转录调控因子Slug高表达不仅能在转录前水平抑制E-cadherin mRNA的表达,还可以通过上调乳腺癌细胞中miR-221的表达,进一步抑制E-cadherin mRNA的翻译,从而促进乳腺癌细胞的迁移。最后我们通过尾静脉注射的方式将不同处理的MDA-MB-231细胞输送进小鼠体内,观察肿瘤迁移能力和成瘤情况,进一步证实了通过抑制miR-221的表达或者表达E-cadherin突变型质粒可以提高乳腺癌细胞E-cadherin的表达量并抑制其迁移能力,为预防乳腺癌的转移提供了新的策略。综上所述,我们研究了miRNA调控疾病发生发展的不同方式和机制,探索了miRNA与疾病治疗的相关性,我们的发现具有重大的临床应用价值。