论文部分内容阅读
目的：研究证明，LIMK（Lim kinase）是调控细胞骨架结构发生改变的重要分子之一，在肿瘤细胞侵袭转移中的作用得到研究者广泛的关注。本实验室前期蛋白质组学检测二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）处理人胃癌MGC803细胞后，LIMK下降。且证明DADS可通过下调LIMK1抑制人胃癌MGC803细胞迁移侵袭，本研究旨在探讨RNA干扰LIMK1对DADS抑制人胃癌MGC803细胞迁移侵袭的作用，以阐明LIMK1是抗肿瘤细胞转移和侵袭的重要分子。方法：RNA干扰人胃癌MGC803细胞LIMK1，RT-PCR和Western blot检测干扰效率；细胞划痕和transwell实验分别检测干扰LIMK1和DADS对人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭能力的影响；Western blot检测Rac1、Rock1、Pak1、LIMK1、cofilin1、p-cofilin1蛋白水平表达。结果：1、pcDNA6.2/LIMK1-miRNA/MGC803重组细胞的构建四组pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-LIMK1干扰质粒及阴性干扰质粒琼脂糖电泳跑胶呈马蹄形，表示质粒提取成功。将提取的5组干扰质粒分别转入MGC803细胞，倒置荧光显微镜下可见细胞发绿色荧光。Western blot结果显示，与未转染组相比，转染LIMK1-miRNA1-4分别使MGC803细胞LIMK1蛋白表达水平下降30%、28%、72%、75%，LIMK1-miRNA4转染组LIMK1蛋白表达抑制最明显（P<0.05），阴性转染组与未转染组相比之间无统计学意义（P>0.05）。RT-PCR结果显示，LIMK1-miRNA1、LIMK1-miRNA4组LIMK1mRNA下降明显。综合Western blot和RT-PCR结果，采用LIMK1-miRNA4/MGC803细胞作为后续实验对象。2、RNA干扰LIMK1对DADS抑制MGC803细胞迁移与侵袭的影响划痕实验显示，24h后，干扰组划痕距离较未干扰组、阴性干扰组增宽（P<0.05）；未干扰组与阴性干扰组无差异（P>0.05）。30mg·L-1DADS处理24h后，干扰组较未干扰组与阴性干扰组明显增宽（P<0.05），未干扰组与阴性干扰组差异无明显差异（P>0.05），干扰组加药前后无意义。表明干扰LIMK1可抑制MGC803细胞迁移。Transwell侵袭实验显示，24h后，干扰组和DADS处理干扰组穿膜细胞较未干扰组、阴性干扰组明显减少（P<0.05）；未干扰组与阴性干扰组差异无统计学意义（P>0.05）。表明干扰LIMK1可抑制MGC803细胞侵袭，并增强DADS抑制MGC803细胞侵袭能力。3. RAN干扰LIMK1与DADS对Rac1-Rock1/Pak1-LIMK1-cofilin1信号通路的影响。Western blot结果显示，干扰组的Rac1、Rock1、Pak1、cofilin1蛋白表达较未干扰组无统计学意义，LIMK1、p-cofilin1蛋白表达均下降，未干扰组与阴性干扰组无统计学意义。30mg·L-1DADS处理24h后，干扰组的Rac1、Rock1、Pak1蛋白表达均较处理前下降，LIMK1、p-cofilin1、cofilin1蛋白表达无差异；未干扰组与阴性干扰组无统计学意义。结论：1、RNA干扰LIMK1可抑制MGC803细胞迁移与侵袭。2、RNA干扰LIMK1增强DADS抑制MGC803细胞侵袭。3、RNA干扰LIMK1可下调磷酸化cofilin1，抑制MGC803细胞迁移与侵袭。