多西环素是一种半合成的四环素类抗生素，具有多方面的抗炎作用。近年来发现多西环素可以诱导多种肿瘤细胞、人体细胞凋亡，其中有参与机体免疫反应的细胞，我们推测诱导炎症细胞凋亡可能是多西环素一个新的抗炎机制。本实验以单核细胞系THP-1为细胞模型，探讨多西环素诱导THP-1细胞凋亡的作用及其机制，为多西环素抗炎作用提供理论依据。 角膜碱烧伤是严重的创伤性眼病，其病理过程复杂，病情严重，治疗棘手，预后差，对人民健康和家庭社会经济造成严重影响。炎症和新生血管是影响角膜碱烧伤愈后的两个重要病理过程。多西环素具有多方面的抗炎作用。近期研究表明多西环素对角膜新生血管也有抑制作用。本实验以大鼠角膜碱烧伤为模型，研究多西环素眼液对角膜碱烧伤炎症过程及新生血管形成的影响，探讨多西环素治疗角膜碱烧伤的机制。 第1章多西环素诱导THP-1细胞凋亡的实验研究。 目的：研究多西环素诱导THP-1细胞凋亡的作用。 方法：以PMA诱导THP-1细胞分化贴壁，分别按5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80mg/L的浓度梯度加入多西环素，作用12 h或48 h，设空白对照组。观察细胞形态变化，采用MTT法检测THP-1细胞活性，AnnexinV和PI双染色后用流式细胞仪检测THP-l细胞早期凋亡，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测THP-1细胞晚期凋亡。 结果：随着多西环素浓度增高，THP-1细胞收缩变圆，细胞间距增宽乃至完全分离，死亡、崩解的THP-1细胞逐渐增多。MTT法显示随着多西环素作用浓度增高，活性THP-1细胞数量逐渐下降。流式细胞仪检测和TUNEL检测显示THP-1细胞的早期凋亡和晚期凋亡率均伴随多西环素作用浓度的升高而升高。 结论：本实验首次阐明多西环素可以诱导人THP-1细胞凋亡，其效应呈明显的剂量依赖关系。 第2章多西环素诱导THP-1细胞凋亡的机制研究。 目的：探讨多西环素诱导THP-1细胞凋亡的分子机制。 方法：以PMA诱导THP-1细胞分化贴壁，按浓度梯度加入多西环素，设空白对照组，按实验目的制作细胞爬片或收集细胞。采用免疫组织化学方法检测THP-1细胞的FasL表达情况。采用PI染色检测THP-1细胞周期。Western blot检测THP-1细胞核NF-κB含量。 结果：多西环素各个浓度处理组未发现THP-1细胞FasL表达增加。各个多西环素处理组和对照组的G1期、G2期及S期细胞百分率两两比较均无统计学差异。多西环素能抑制NF-κB转移至核内发生生物学效应，其效应呈剂量依赖关系。 结论：多西环素可能通过抑制NF-κB活性诱导THP-1细胞凋亡。 第3章多西环素抑制碱烧伤大鼠角膜的炎症细胞浸润。 目的：研究多西环素抑制碱烧伤大鼠角膜炎症反应的作用及分子机制。 方法：制作大鼠角膜碱烧伤模型，设对照组、地塞米松组和多西环素组，分别点眼液溶媒、0.1﹪地塞米松眼液和0.5﹪多西环素眼液，于碱烧伤后第3、7、14、21天随机取4只大鼠，诱导麻醉后裂隙灯观察照相，计算炎症指数。随后处死，角膜取材，一半角膜10﹪福尔马林固定行病理组织切片，HE染色，进行炎症细胞计数，另一半-80℃保存，备ELISA检测。角膜组织病理切片行原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测。 结果：各时间点多西环素组炎症指数低于对照组，差异具有统计学意义。多西环素抑制炎症作用与地塞米松组比较无统计学差异。各时间点多西环素组炎症细胞计数低于对照组，差异具有统计学意义。多西环素抑制炎症细胞浸润的作用与地塞米松组比较无统计学差异。各时间点多西环素组角膜ICAM-1浓度低于对照组，除第7天p值为0.072外，其余各组差异均具有统计学意义。地塞米松抑制ICAM-1表达的作用强于多西环素。角膜组织原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测显示，对照组偶有炎症细胞凋亡，地塞米松组无炎症细胞凋亡，多西环素组有明显增多的炎症细胞凋亡。 结论：多西环素可能通过降低ICAM-1的表达及诱导炎症细胞凋亡抑制碱烧伤大鼠角膜的炎症细胞浸润。 第4章多西环素抑制碱烧伤大鼠角膜的新生血管形成。 目的：研究多西环素抑制碱烧伤大鼠角膜新生血管形成的作用及可能机制。 方法：脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定，加入梯度浓度的多西环素，观察多西环素对脐静脉内皮细胞增殖活性的影响。制作大鼠角膜碱烧伤模型，设对照组、地塞米松组和多西环素组，分别点眼液溶媒、0.1﹪地塞米松眼液和0.5﹪多西环素眼液，于碱烧伤后第3、7、14、21天随机取4只大鼠，诱导麻醉后裂隙灯观察照相，计算炎症指数及新生血管面积。随后处死，角膜取材，一半角膜10﹪福尔马林固定行病理组织切片，HE染色，进行炎症细胞计数，另一半-80℃保存，备ELISA检测。 结果：脐静脉内皮细胞阳性表达CD31和CD34。在多西环素作用下，脐静脉内皮细胞增殖活性受到抑制，呈剂量依赖关系。各时间点多西环素组炎症指数低于对照组，差异具有统计学意义。多西环素抑制炎症作用与地塞米松组比较无统计学差异。各时间点多西环素组炎症细胞计数低于对照组，差异具有统计学意义。多西环素抑制炎症细胞浸润的作用与地塞米松组比较无统计学差异。地塞米松组和多西环素组的各时间点新生血管面积均小于对照组，差异具有统计学意义。地塞米松组第3、7天新生血管面积小于多西环素组，差异具有统计学意义。各组的新生血管面积与炎症指数呈正相关关系。多西环素组各时间点角膜VEGF表达低于对照组，差异无统计学意义。地塞米松组第3、7天角膜VEGF表达低于对照组，第14、21天表达高于对照组，差异无统计学意义。各组炎症细胞计数与角膜VEGF表达呈正相关关系。 结论：多西环素可能通过抑制血管内皮细胞增殖和下调VEGF表达抑制碱烧伤大鼠角膜新生血管形成。