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肝母细胞瘤(Hepatoblastoma,HB)是小儿最常见的肝脏恶性肿瘤,近年来,随着对小儿HB的发生、发展认识的加深与综合治疗的广泛开展,小儿HB的治疗效果得到了显著提高。但是,晚期或有远处转移的HB患儿的病死率仍较高,尤其对某些HB复发与转移的病例治疗还相当棘手,严重影响患儿预后。随着现代分子生物学的发展,生物靶向治疗已经成为肿瘤研究与临床治疗的热点。但小儿恶性实体肿瘤的靶向治疗目前尚处于起步阶段。尤其是针对小儿HB的靶向治疗的研究与应用文献甚少。研究证实,EpCAM(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)的表达多见于成人上皮来源恶性肿瘤,且其高表达与肿瘤的预后明显相关。但EpCAM表达与小儿实体肿瘤的关系研究还不多见。现在EpCAM单克隆抗体已进行了成人结、直肠癌,乳腺癌,卵巢癌等恶性肿瘤的临床实验研究,取得了一定的治疗效果。本文拟对EpCAM的表达与HB的临床病理参数及临床意义进行研究,并通过动物实验,探讨EpCAM单克隆抗体靶向治疗的可行性。第一部分Ep CAM在小儿HB的表达及其临床意义目的:免疫组化染色检测Ep CAM在小儿HB中的表达,探讨其表达与HB各临床病理参数的关系及其意义。方法:回顾性分析上海交通大学附属儿童医院2010.01-2015.11期间收治的病理证实为HB的患儿共31例,其中随访资料完整共26例。采用Elivision两步法免疫组化技术检测26例HB肿瘤组织Ep CAM蛋白的表达情况,并探讨Ep CAM的表达与HB患儿年龄、性别、PRETEXT分期、AFP水平、病理类型等参数的关系。计量资料采用χ~2检验,计数资料采用t检验,Kaplan-Meier法进行生存分析并绘制生存曲线,应用breslow进行差异性检验,所有统计学分析均采用SPSS22软件进行。结果:1.26例HB患儿,男19例,女7例,年龄6-108月(中位年龄27.2月)。所有患儿采用PRETEXT分期方法进行分期,其中Ⅰ期3例,Ⅱ期5例,Ⅲ期13例,Ⅳ期5例。术前AFP>1000ng/ml共22例,<1000ng/ml共4例。术后病理提示单纯胎儿型6例,混合型16例,胚胎型4例。其中19例(73.1%)呈Ep CAM阳性表达,7例(26.9%)为阴性表达。Ep CAM在HB组织中阳性表达主要位于细胞膜,部分弥散至胞浆。2.PRETEXTⅠ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期HB患儿的3年总生存率(overall survival rate,OS)分别:66.7±2.72%,80±17.9%,42.3±16.5%,60±21.9%。Ep CAM阳性患儿和阴性患儿3年OS为分别48.4%和80%(P<0.05)。Ep CAM的表达情况与患儿年龄、性别、术前AFP水平、分期、病理类型无明显相关性(均P>0.05)。结论:Ep CAM在大部分HB中均有表达,其表达与患儿的年龄、性别、肿瘤分期、病理类型无明显相关性,但Ep CAM阴性患儿3年OS显著高于Ep CAM阳性患儿。表明Ep CAM的表达与其HB患儿的预后有一定的相关性,可成为小儿HB的肿瘤标志物之一,并有可能成为HB靶向治疗的潜在靶点之一。第二部分Ep CAM单克隆抗体HB靶向治疗的实验研究目的:观察Ep CAM单克隆抗体对人HB肿瘤细胞裸鼠动物模型靶向治疗的疗效。方法:1.体外培养小儿HB Hu H-6细胞,免疫组化检测Hu H-6细胞的Ep CAM表达。2.在10只裸鼠皮下接种Hu H-6细胞,建立稳定的Hu H-6细胞荷瘤鼠模型后。将荷瘤鼠随机分二组:组1为实验组,经鼠尾静脉注射Ep CAM单克隆抗体(购自abcam公司),剂量30ug/kg,每天1次。组2为对照组,经鼠尾静脉注射等量生理盐水。干预3周后停药,取肿瘤组织进行病理切片检查,并通过免疫组化染色检测移植瘤Ep CAM的表达。通过测量移植瘤体积、重量,计算抑瘤率。结果:1.Hu H-6细胞系传代培养成功,镜下可见肿瘤细胞呈梭形,大小一致,细胞核大,核深染。免疫组化染色检查可见Ep CAM阳性肿瘤细胞膜呈棕黄色颗粒。2.接种Hu H-6细胞4周后,裸鼠皮下即可出现肿块;6周时肿块直径可增大至4-5mm。此时进行干预实验,3周后取裸鼠皮下肿瘤组织,病理切片检查证实为HB。3.与对照组相比,Ep CAM单克隆抗体能明显抑制试验组裸鼠移植瘤的生长,表现为肿瘤体积明显缩小(1.12±0.09cm~3 vs 1.37±0.77 cm~3,p=0.002),瘤体重量减轻(35.6±2.97mg vs 45.8±4.59mg,p=0.003)。Ep CAM单克隆抗体抑瘤率达22%。结论:动物实验结果表明,Ep CAM单克隆抗体能够抑制HB荷瘤鼠肿瘤的生长,表明其对小儿HB有潜在的靶向治疗作用;为Ep CAM单克隆抗体在小儿HB临床应用提供了一定的实验基础。