基于酶促等温指数扩增技术的生物传感方法研究

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酶促等温指数扩增技术(IEXPAR),是一种结合单链剪切和聚合酶延伸的等温扩增技术,这种技术具有很高的扩增效率。其特点在于利用特殊的切刻内切酶识别特异的碱基序列并且只剪切双链 DNA中的一条链。在聚合酶的作用下,以双链DNA中未被剪切的DNA链作为模板从剪切断端开始发生聚合反应,通过链置换的方式置换下被剪切的那条DNA链。同时,新合成的DNA双链在两种酶作用下又发生新的剪切和聚合反应,从而连续不断地生成大量的单链DNA。本研究利用此技术中内切酶具有特异性的识别能力和等温扩增反应扩增出的单链易于检测等优点,制备了两种生物传感器分别用于核酸和蛋白的检测。  1.基于酶促等温指数扩增技术的电化学生物传感方法研究  本节描述了一种基于酶促等温指数扩增技术的电化学生物传感器用于双链基因的检测。天然条件下生物体中的DNA都是长的双链状态,这就导致了其很难被直接检测。本方法首先用切刻内切酶特异性的切割双链目标物中的一条链,然后断端在聚合酶的作用下发生延伸反应,随后以链置换的方式得到一条长的单链。长单链可以催化发夹自组装反应,生成新的双链DNA,然后引发新的等温扩增反应并生成短单链。短单链可以与金电极表面发夹结构的捕获探针结合并产生信号的改变。本方法对双链DNA检测具有良好的分析性能,其检测范围为2 fM到500 pM,最低检测线为1.6 fM。  2.基于核酸自组装结构构象变化和酶促等温指数扩增技术的荧光生物传感方法研究  本节描述了一种基于核酸自组装结构构象变化和酶促等温指数扩增技术的荧光生物传感方法用于VEGF的检测。这种核酸自组装结构包括一条等温扩增模板链,一条适配体链,一条引物链和一条封闭链。在没有目标物存在的情况下,该结构的构象稳定并且不会发生等温扩增反应。当目标物存在时,自组装结构发生构象变化,致使引物链与模板链完全杂交,从而触发等温扩增反应。扩增反应产生的单链与分别标记有荧光物和淬灭物的双链DNA发生链置换反应,产生荧光信号的增加。本方法为VEGF的检测提供了一种灵敏、特异和简单的思路。该荧光传感器对于血清中的VEGF检测具有很好的效果。
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