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研究目的：1、阐明小细胞肺癌细胞系H446中uPAR+细胞的干细胞特性。2、证明uPAR+细胞群进一步可分为uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4+亚群,其中uPAR+CXCR4+亚群细胞是转移性肿瘤干细胞。研究方法：1、首先用流式细胞分选术从小细胞肺癌细胞系H446中分选出uPAR+和uPAR+细胞,然后通过①裸鼠体内成瘤实验,②体外无血清成球实验,③细胞分化实验,④Transwell体外侵袭实验,比较上述两组细胞的致瘤能力、自我更新能力、分化潜能和侵袭能力,从而证明uPAR+细胞具有干细胞特性。2、进一步用流式细胞术检测uPAR+细胞亚群中CXCR4的表达,通过uPAR-FITC和CXCR4-PE双荧光抗体标记的方法证实存在uPAR+CXCR4+细胞亚群,并分选出uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4+细胞。通过①Transwell迁移实验,比较上述两组细胞体外迁移能力,②裸鼠皮下接种上述两组细胞,构建小鼠体内转移瘤模型,比较这两组细胞的体内迁移能力,从而证明uPAR+CXCR4+亚群细胞是转移性肿瘤干细胞。3、通过免疫组织化学法,观测人小细胞肺癌组织中uPAR和CXCR4的表达和分布,并分析其与临床参数的关系。结果：1.uPAR+细胞具有干细胞特性(1)uPAR+细胞具有高致瘤能力。流式细胞术分选出uPAR+和uPAR+细胞,在裸鼠皮下分别接种103个不同亚群细胞。一周后,接种uPAR+细胞组小鼠皮下形成直径约3mm的移植瘤,而接种uPAR+细胞的小鼠未见瘤形成。将uPAR+细胞形成的原代移植瘤分割成2mm3小块继续接种于裸鼠皮下,形成第二代移植瘤,以此进行连续传代。在连续传代过程中,uPAR+细胞保持了致瘤的稳定性,至今已在体外连续传代12次,且uPAR+细胞在移植瘤中的表达率基本保持不变。三代以后瘤形成时间缩短,肿瘤生长速度明显加快。(2)uPAR+细胞具有自我更新能力。将分选的uPAR+和uPAR+细胞分别按1×103/mL密度用无血清培养基接种于六孔板内。培养三天后观察到uPAR+细胞有所含细胞数约为10个左右的肿瘤细胞球形成,呈悬浮生长；7天后每个球体所含细胞数有几十个甚至上百个。而uPAR+细胞三天时未见肿瘤细胞球形成,7天时细胞均已死亡。(3)uPAR+细胞具有分化能力。将分选的uPAR+和uPAR+细胞置于含有10%血清的分化培养基中,生长三天后对分化细胞进行免疫荧光检测,结果显示：分选的uPAR+细胞高表达uPAR,不表达Cytokeratin和CD56,培养三天后失表达uPAR,高表达Cytokeratin和CD56;uPAR+细胞标志物未见明显改变,始终不表达uPAR,高表达Cytokeratin和CD56。进一步,将两组细胞分别放入含有VEGF因子存在的三维培养基中,经一周培养,uPAR+细胞分化形成管腔样结构,免疫荧光染色uPAR表达下降,可见血管内皮细胞标志物CD31的表达；接种uPAR+细胞的裸鼠移植瘤组织中可见少量肿瘤细胞有血管内皮细胞标志物Ⅷ相关抗原表达。而uPAR+细胞在上述实验中既无管腔样结构形成也不表达血管内皮标志物。(4)uPAR+细胞具有高侵袭性。通过Transwell侵袭实验比较发现,uPAR+细胞穿过基底膜的数量大于uPAR+细胞(P<0.05),提示uPAR+细胞侵袭能力大于uPAR+细胞。进一步,免疫荧光染色显示：uPAR+细胞不表达上皮细胞标志物E-cadherin,高表达间质细胞标志物Fibronectin和Vimentin.表明其侵袭机制可能和细胞发生EMT有关。2、转移性肿瘤干细胞uPAR+CXCR4+亚群的分离鉴定流式细胞术检测CXCR4在uPAR+细胞中的表达：用uPAR-FITC和CXCR4-PE双荧光抗体标记H446细胞,流式分析结果显示：H446细胞中存在uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4+细胞亚群,其含量分别为1.3%和7.1%,证实uPAR+细胞可进一步分为uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4+细胞亚群。(1)Transwell迁移实验结果：通过Transwell迁移实验比较uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4+细胞的迁移能力,结果显示：在SDF-1趋化下,uPAR+CXCR4-组细胞穿过基底膜数明显多于uPAR+CXCR4+组细胞(P<0.05)。两组细胞加入AMD3100预处理后,在SDF-1趋化下穿过基底膜细胞数无明显差异(P>0.05)。提示uPAR+CXCR4+细胞亚群具有很高的迁移能力,其迁移能力与CXCR4的作用密切相关。(2)体内转移实验结果：裸鼠皮下分别接种103个uPAR+CXCR4+和uPAR+CXCR4细胞,一周后均有移植瘤形成,两组细胞的移植瘤大小和生长速度均无显著差异。但8周后处死小鼠,解剖和镜下检查观察到接种uPAR+CXCR4+细胞组的小鼠皮下移植瘤向肌层浸润,并可见肺内转移,而接种uPAR+CXCR4+细胞的小鼠未见任何器宫转移。3、uPAR和CXCR4在人小细胞肺癌组织的表达及意义50例人体小细胞肺癌组织标本中有17例呈uPAR阳性表达,阳性细胞数极少且表达多分布于癌巢周边。uPAR阳性表达组病人肿瘤大小明显大于uPAR阴性组(P<0.05),且uPAR阳性表达组患者生存时间短于uPAR阴性组(P<0.05)。全部50例标本中CXCR4均呈强阳性表达,CXCR4的表达与临床参数无必然联系。结论：1、小细胞肺癌细胞系H446中,uPAR+细胞具有高致瘤性和自我更新能力。2、uPAR+细胞具有向上皮细胞和神经内分泌细胞分化的能力,并可能具有向血管内皮细胞分化的潜能。3、uPAR+细胞具有高侵袭性,其高侵袭能力可能与细胞发生了EMT有关。4、uPAR+细胞群进一步可分为uPAR+CXCR4和uPAR+CXCR4+亚群。5、uPAR+CXCR4+细胞在体外Transwell实验中显示迁移能力强于uPAR+CXCR4+细胞,提示其具有较强的迁移能力。6、uPAR+CXCR4+细胞接种到裸鼠皮下可形成肺转移瘤,提示uPAR+CXCR4+亚群是与转移瘤形成相关的细胞亚群。7、小细胞肺癌患者瘤内uPAR的表达与肿瘤大小和患者的低生存率有关。