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皮肤是过敏和炎症疾患的频发位点,发病机制比较复杂。实验研究证明,角质形成细胞和真皮成纤维细胞在皮肤过敏、炎症和免疫中起重要作用。两种细胞均可以产生多种参与炎症反应、调解免疫功能的细胞因子,如IL-6、IL-8、γ- 干扰素(IFN-γ)及单核趋化蛋白等,诱导炎症细胞浸润,最终引起炎症的发生。组胺是速发型超敏反应和相关皮肤病,如荨麻疹和特应性皮炎的重要介质。研究报道显示,除了对血管和腺体有影响外,它还在细胞因子释放和粘附过程中发挥重要作用,在过敏性炎症中发挥的调节作用是通过组胺受体所介导的。组胺H1受体( Histamine receptor 1,H1R),与过敏炎症的关系最为密切,其在许多组织和细胞中均有功能性表达,在过敏疾病的病理过程中呈现高表达,可以激活核转录因子NF-κB,它在炎症基因表达中起关键作用,预示着H1R可以调节许多炎症细胞因子的表达,进而诱导炎症的发生。因此,研究组胺受体在皮肤细胞上的表达和调节对过敏炎症的防治有理论指导意义。目前临床上常采用抗组胺药物防治过敏性疾病。有研究报道,有些抗组胺药物不仅能缓解过敏反应症状,而且具有抗炎作用,能抑制嗜酸粒细胞的趋化作用,对IFN-γ诱导的粘附分子表达有抑制作用。IFN-γ作为TH1细胞分泌的主要细胞因子,在T细胞驱动的皮肤炎症性疾患中起重要作用,它可以刺激趋化因子合成,诱导保留和激活T细胞分子表达,进而扩大了炎症反应。抗组胺药物的抗炎机制研究,可进一步阐明其作用途径及作用靶点。国外对组胺受体在角质形成细胞和皮肤成纤维细胞的表达只有零散研究,抗组胺药物对皮肤细胞的抗炎作用报道也很少,国内此几方面的研究尚未见报道。因此,我们以组胺和IFN-γ处理皮肤细胞,体外模拟皮肤炎症状态,探讨这两种细胞上组胺受体的表达;研究第二代抗组胺药物西替利嗪对皮肤炎症的调节,考察其H1R依赖性抗炎和非依赖性抗炎的作用机制,目的是进一步提供其作为防治过敏和免疫炎症有效药物的理论依据。 <WP=6>主要研究结果如下:一 真皮成纤维细胞及人角质形成细胞H1R和H2R表达研究 1 采用流式细胞分析方法(Flow cytometry,FC),应用FITC-labeled histamine与细胞表面组胺受体结合的原理,对受体的表达进行测定。结果显示,FITC-labeled histamine与真皮成纤维细胞和角质形成细胞中组胺受体的结合被预孵的组胺、H1R、H2R拮抗剂和激动剂所阻断。两种细胞分别被组胺拮抗了约44%和69%、被美吡拉敏拮抗了约41%和59%、被西米替丁拮抗了约12%和30%、被HTMT拮抗约31%和64%、被dimaprit拮抗约16%和38%。此结果预示着两种细胞均表达H1R,而H2R可能只表达于角质形成细胞上。2 采用RT-PCR技术检测H1R、H2R在两种细胞上的表达。结果显示,真皮成纤维细胞上只检测到H1R mRNA表达,角质形成细胞上则有H1R、H2R mRNA表达,且H1R mRNA比H2R mRNA的表达量高;而且还发现,组胺使两种细胞的H1R mRNA的表达有所增加,IFN-γ则使真皮成纤维细胞的H1R mRNA的表达增加比较显著,TNF-α降低了两种细胞H1R mRNA的表达,提示H1R mRNA受细胞因子和炎症介质的调节。3 采用免疫组化(Immunohistochemistry,IH)和Western Blot 技术检测两种细胞上H1R的蛋白表达。结果显示,两种细胞上均有H1R的蛋白表达,且真皮成纤维细胞上H1R的蛋白表达量高。用10-5 mol/L组胺、20 ng/mL IFN-γ和TNF-α刺激细胞24 h后,组胺和IFN-γ使真皮成纤维细胞的蛋白表达分别增加了约9%和47.3%,而TNF-α则降低了15.7%,角质形成细胞中H1R蛋白表达与真皮成纤维细胞相似,提示细胞因子对H1R的调节可能在过敏和免疫炎症中发挥作用。二 组胺、IFN-γ及西替利嗪对真皮成纤维细胞和角质形成细胞IL-8、MCP-1、ICAM-1表达的调节1 采用RT-PCR法检测,考察在西替利嗪存在和不存在的条件下,组胺对IL-8 mRNA表达的影响。发现组胺增加了两种细胞IL-8 mRNA表达,而西替利嗪则下调了组胺诱导的IL-8 mRNA表达。2 应用ELISA测定西替利嗪对组胺诱导两种细胞IL-8蛋白分泌的影响。结果表明, 10-6～10-4 mol/L组胺显著地诱导了两种细胞IL-8蛋白分泌,其中10-5 mol/L <WP=7>组胺诱导的真皮成纤维细胞和角质形成细胞IL-8蛋白分泌量分别为基础分泌量的1.6倍和2.1倍; 10-5、10-4 mol/L西替利嗪则显著地抑制了诱导作用(p<0.05 vs histamine group)。3 采用RT-PCR法检测,考察组胺和IFN-γ对MCP-1 mRNA表达的影响。结果显示,组胺和IFN-γ增加了两种细胞MCP-1 mRNA的表达,且IFN-γ的增加非常显著。4 应用ELISA测定西替利嗪对组胺诱导两种细胞MCP-1蛋白分泌的影响。结果表明, 10-5 mol/L组胺和20 ng/mL IFN-γ诱导的真皮成纤维细胞MCP-1蛋白分泌分别为基础分泌量的4.5倍和9.4倍(p<0.001 vs control group); 10-6、10-5mol/L西替利嗪则显著地抑制了组胺的诱导作用(p<0.05 vs histamine group),对IFN-γ的诱导作用表现出更强烈的抑制作用(p<0.01 vs IFN-γ group)。10-5 mol/L组胺和20 ng/mL IFN-γ也显著地诱导角质形成细胞MCP-1蛋白分泌(p<0.05 vs control group); 10-6、10-5mol/L 西替利嗪显著地抑制了组胺和IFN-γ的诱导作用(p<0.05 vs histamine and IFN-γgroup)。结果提示我们,西替利嗪能阻断IFN-γ诱导的角质形成细胞和