獭兔是著名的裘皮用兔,主要产品是獭兔皮,具有重要的经济价值。被毛密度是评定獭兔皮张质量的重要指标之一。近年来,如何提高獭兔皮张质量中的被毛密度成为獭兔研究中的热点。被毛由毛囊生成,毛囊是皮肤附属器官,由表皮和真皮相互作用形成,能够控制被毛生长,且具有独特的生理结构和周期性生长的特性。毛囊的形成与分化过程中,有毛乳头、毛母质、内根鞘、外根鞘等20多种不同类型的细胞参与。毛乳头细胞是动物皮肤中的一类特异化的间充质来源的细胞,在毛囊周期生长变化过程中发挥重要调控作用,是整个毛囊中直接参与毛囊周期生长调控的关键组分。miRNA是大小约为20~24个核苷酸的一类非编码小分子RNA,近年的研究报道miRNA在小鼠、大鼠、山羊和绵羊等多种哺乳动物毛囊形态发生,毛囊干细胞增殖分化和凋亡中发挥了重要的调控作用。本课题首先对獭兔皮肤毛乳头细胞进行分离培养鉴定,然后对不同被毛密度獭兔毛乳头细胞进行差异表达的miRNA筛选,最后对维生素B6通过miRNA调控獭兔毛囊发育作用机制进行研究,以期为提高獭兔皮张质量提供新的思路和线索。研究的主要内容如下:1.獭兔皮肤毛乳头细胞的分离培养及鉴定选取30 d獭兔,背部剃毛后屠宰,碘酊消毒后剪取皮肤置于100 U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的无菌PBS中,75%酒精浸泡后用无菌剪刀剪成2 cm*5 cm皮条,至于0.25 mg/mLⅡ型分离酶溶液中4℃过夜消化,次日37℃培养箱中消化30 min后PBS冲洗,揭去表皮。将真皮部分剪碎,至于0.1 mg/mL D型胶原酶中37℃消化4~6 h,显微镜下可见大量毛乳头游离出来时,用含FBS的DMEM终止消化,差速离心后用70μm滤器过滤后,去除未消化的组织。基础培养基重悬细胞,铺板,37℃,5%CO2培养箱培养。经过形态学观察、生长曲线绘制及毛乳头细胞特异表达物Vim和α-SMA细胞免疫化学鉴定,该方法分离培养所获得的细胞为獭兔皮肤真皮源性毛乳头细胞。2.不同被毛密度獭兔毛乳头细胞小RNA表达谱分析分别构建30 d高低被毛密度獭兔皮肤毛乳头细胞小RNA文库,并进行高通量测序,结果显示6个小RNA文库分别获得的高质量序列读数分别为37930744、39442011、40965907、38502653、40622117、41149163,其中绝大多数序列长度在23 nt,与哺乳动物miRNA的大小一致。将干净序列和已知的小RNA数据库进行比对,6个文库中大约90%以上的序列可以匹配,分别为91.91%、91.05%、92.46%、92.77%、90.13%、91.61%。小RNA分类注释结果显示,miRNA分别占到80.80%、82.50%、81.60%、85.80%、76.50%、81.8%。通过DEGs筛选了240个显著差异表达miRNA,包括122个上调miRNA和118个下调miRNA。其中,显著差异表达的ocu-miR-205在高被毛密度獭兔皮肤毛乳头细胞中低表达,在低被毛密度獭兔皮肤毛乳头细胞中高表达,且在獭兔皮肤中高表达,具有表达组织特异性。差异miRNA靶基因GO分析结果显示,这些靶基因被富集到生物学过程、细胞组分和分子功能等多个GO条目中,KEGG富集分析显示,24162个差异表达miRNA靶基因被注释到Pathway中的325条通路,其中富集程度排名靠前的有Wnt信号通路、Notch信号通路等条目。3.ocu-miR-205对獭兔毛乳头细胞影响的研究构建HBAD-GFP,HBAD-ocu-miR-205-GFP,HBAD-ocu-miR-205-5p-sponge-GFP腺病毒,以MOI 200转染獭兔毛乳头细胞。转染后24h观察转染效果,48 h检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、ocu-miR-205-5p及毛囊发育相关基因和蛋白变化。结果表明,构建的腺病毒能够成功转染獭兔毛乳头细胞,且过表达后ocu-miR-205-5p表达量显著升高,干扰表达后ocu-miR-205-5p显著降低(P<0.05)。ocu-miR-205能够提高细胞凋亡率,同时改变细胞周期进程,提高细胞增殖(P<0.05)。ocu-miR-205能够显著抑制PI3K/Akt信号通路中Inppl1、Frk和Phlda3基因表达(P<0.05);显著促进Wnt信号通路中DKK1基因表达,显著抑制Wnt10b、Fzd4、Lrp5、Lrp6、CTNNB1、Axin、APC、GSK-3β、TCF3和Lef1基因表达(P<0.05);显著抑制Notch信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1和Hes5基因表达(P<0.05);显著促进BMP信号通路中BMP2、BMP4和TGF-β1基因表达;显著影响IGF1、EGF、FGF5、FGF7、SHH和TNF等毛囊发育相关因子的基因表达(P<0.05)。ocu-miR-205能够显著抑制CTNNB1、Akt蛋白磷酸化水平和NOG蛋白表达水平,促进GSK-3β蛋白磷酸化(P<0.05)。4.ocu-miR-205对獭兔皮肤组织影响的研究选择100只体重相近健康状况良好的3月龄獭兔,随机分为4组,背部皮肤局部剃毛后,以每只獭兔50μL分别皮内注射HBAD-GFP、HBAD-ocu-miR-205-GFP、HBAD-ocu-miR-205-5p-sponge-GFP腺病毒。注射转染24 h后,每组选取1只观察转染效果,并分别在7 d、14 d和21 d每组分别随机选取獭兔各8只,屠宰后采集注射部位皮肤置于冻存管和4%多聚甲醛固定液中,冻存样品用于检测ocu-miR-205-5p及毛囊发育相关基因蛋白变化;固定样品用于制作石蜡切片,HE染色后统计被毛密度。结果表明,构建的腺病毒能够成功转染獭兔皮肤及毛囊,且过表达后ocu-miR-205-5p表达量显著升高,干扰表达后ocu-miR-205-5p显著降低(P<0.05)。ocu-miR-205能够显著影响PI3K/Akt、Wnt、Notch和BMP信号通路中基因表达(P<0.05);显著影响毛囊发育相关因子的基因表达量(P<0.05)。ocu-miR-205能够显著影响CTNNB1、GSK-3β、Akt蛋白磷酸化水平和NOG蛋白表达水平(P<0.05)。ocu-miR-205过表达后,初级毛囊密度无显著变化(P>0.05),次级毛囊密度和总毛囊密度显著降低(P<0.05);ocu-miR-205-5p干扰表达后,初级毛囊密度无显著变化(P>0.05),次级毛囊密度和总毛囊密度显著升高(P<0.05);在注射14 d,ocu-miR-205-5p干扰表达组次/初比(S/P)显著升高(P<0.05)。5.维生素B6对獭兔毛乳头细胞影响的研究在基础培养基加入0、10、20、40、80、160μmol/L浓度维生素B6,培养72 h观察维生素B6对毛乳头细胞细胞增殖、细胞周期、ocu-miR-205-5p和毛囊发育相关基因蛋白表达量的变化。MTT结果显示在培养基中添加160μmol/L的维生素B6 OD值显著低于其他各组(P<0.05)。添加维生素B6组与不添加对照组相比细胞周期有明显差异,处于G0/G1期的细胞比率显著低于对照组(P<0.05),G2/M期细胞比率显著高于对照组(P<0.05),对S期细胞比率无显著影响(P>0.05)。适宜浓度(10和20μmol/L)的维生素B6能够显著抑制细胞凋亡(P<0.05),但高浓度(80和160μmol/L)的维生素B6能够显著促进细胞凋亡(P<0.05)。维生素B6能够显著影响ocu-miR-205-5p的表达(P<0.05),随着培养液中维生素B6浓度的增大,ocu-miR-205-5p的表达量显著降低P<0.05)。维生素B6能够促进PI3K/Akt信号通路中Inppl1、Inpp4b和Phlda3基因表达(P<0.05);促进Wnt信号通路中Wnt10b、Fzd4、Lrp6、CTNNB1、APC和Lef1基因表达,抑制DKK1(P<0.05);显著促进Notch信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1和Hes5基因表达(P<0.05);BMP信号通路中BMP2、BMP4和TGF-β1基因表达无显著影响(P>0.05);显著影响毛囊发育相关因子IGF1、EGF、FGF5、SHH和TNF的基因表达量(P<0.05)。维生素B6能够显著促进CTNNB1、Akt蛋白磷酸化水平和NOG蛋白表达水平,显著抑制GSK-3β蛋白磷酸化水平(P<0.05)。6.维生素B6对獭兔毛囊毛干生长影响的研究选取30 d獭兔,屠宰后剪取触须部皮肤,75%酒精浸泡后用无菌剪刀剪成2 cm*5cm皮条置于0.2 mg/mL D型胶原酶4℃过夜消化,解剖显微镜下分离游离毛囊。将所得的触须毛囊随机分为6组,每组10根,加入维生素B6浓度为0、10、20、40、80和160μmol/L的William E基础培养液,31℃,5%CO2培养。共培养6 d,每隔24 h统计毛干生长长度。结果表明:体外培养的獭兔触须毛囊培养144 h生长长度达到23.33μm,平均生长速度为3.89μm/d,且前期生长速度快于后期。培养液中添加维生素B6后,能够促进毛干生长速度,80μmol/L的添加组培养144 h生长长度达到36.15μm,平均生长速度最快,为6.03μm/d,显著高于对照组(P<0.05)。因此,维生素B6能够促进毛干生长速度,延缓毛囊衰退死亡。7.维生素B6对獭兔生产性能及毛囊发育影响的研究试验选取200只3月龄健康獭兔,随机分成5组,分别饲喂在基础饲粮中添加0、5、10、20和40 mg/kg维生素B6,经过预试期7 d后进入54 d正试期。试验结果表明:维生素B6能够显著影响ADG和ADFI(P<0.05),随着维生素B6添加水平的升高,F/G有先降低后升高趋势,并在20 mg/kg时达到最低值。维生素B6对獭兔皮张重量和对皮张面积有显著影响(P<0.05),其中20 mg/kg添加组的皮张重量和皮张面积高于对照组。饲粮维生素B6对总毛囊密度、次级毛囊密度和S/P影响显著(P<0.05),随着饲料中维生素B6添加水平的升高,毛囊密度先增大后降低,并在20 mg/kg时达到最大值。维生素B6能够显著影响ocu-miR-205-5p的表达(P<0.05),随着饲粮中维生素B6水平增大,ocu-miR-205-5p的表达量显著降低(P<0.05)。饲粮维生素B6能够显著提高PI3K/Akt信号通路中Inppl1基因表达(P<0.05);显著促进Wnt信号通路中Wnt10b、Fzd4、CTNNB1和APC基因表达,显著抑制Wnt信号通路中GSK-3β的表达(P<0.05);显著提高Notch信号通路中Notch1、Hes1和Hes5基因表达(P<0.05);对BMP信号通路中BMP2、BMP4和TGF-β1基因表达无显著影响(P>0.05);显著影响毛囊发育相关因子IGF1、IGF1R、EGF、FGF5和SHH的基因表达量(P<0.05)。维生素B6能够显著提高CTNNB1和Akt蛋白磷酸化水平,降低GSK-3β蛋白磷酸化水平(P<0.05)。综上所述,维生素B6提高獭兔被毛密度的分子机理是通过抑制ocu-miR-205-5p表达,激活PI3K/Akt、Wnt和Notch等信号通路中相关基因和蛋白的表达,使毛囊生长期延长,推迟休止期到来。