目的：　　通过利用角膜捐献者的部分供体角膜组织、真菌性角膜炎的角膜组织和人角膜上皮细胞（HCECs）来探索白细胞介素-32（IL-32）及其结合蛋白-蛋白酶3（PR3）在正常角膜和真菌性角膜炎的角膜中的表达、功能和调节，并探讨IL-32/PR3信号通路在真菌性角膜炎中参与免疫反应的机制。　　方法：　　实验材料选取15例（15眼）真菌性角膜炎的患者经角膜移植术后取下的角膜和15例（15眼）健康捐献者的角膜经过角膜移植术后剩余的健康角膜组织，用于进行实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫印迹法（Western Blot）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测；另外10例（10眼）真菌性角膜炎的角膜和其余10例（10眼）健康捐献者的角膜组织用于制作为观察蛋白质水平提供免疫荧光检测的切片；10例（10眼）真菌角膜炎的石蜡切块进行免疫组织化学染色以观察蛋白质的表达情况；标准烟曲霉菌菌株和人角膜上皮细胞（HCECs）用于烟曲霉菌培育和角膜上皮细胞培养，并由烟曲霉菌菌丝悬液刺激角膜上皮细胞后，进行RT-PCR、Western Blot和ELISA检测。　　根据研究目的采用不同的实验分组和实验方法。　　1. 实验分为正常人角膜组织组和真菌感染人角膜组织组。通过RT-PCR、免疫荧光染色法分别对正常角膜和真菌感染角膜中IL-32的mRNA和蛋白质的表达水平进行检测。　　2. 实验分为正常角膜上皮细胞组和烟曲霉菌感染角膜上皮细胞组。培育烟曲霉菌并制成烟曲霉菌菌丝悬液，人角膜上皮细胞培养完成后由灭活的烟曲霉菌菌丝刺激液进行刺激，在感染后的4、8、12和16小时分别收集细胞，通过RT-PCR、Western Blot和免疫荧光染色法对正常角膜上皮细胞和烟曲霉菌感染的角膜上皮细胞中IL-32的mRNA和蛋白质的表达水平进行检测。　　3. 实验将烟曲霉菌感染的角膜上皮细胞分为对照组和重组人IL-32组（重组人IL-32预处理烟曲霉菌感染角膜上皮细胞组）。重组人IL-32组是角膜上皮细胞在受到烟曲霉菌感染之前在10 ng/ml 重组人IL-32中预处理10小时，感染烟曲霉菌后0、4、8、12和16小时分别收集细胞，通过RT-PCR和ELISA检测两组角膜上皮细胞中促炎症细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白质的表达水平。　　4. 使用TLR4抑制剂CLI-095和Dectin-1拮抗剂Laminarin作用于角膜上皮细胞，观察IL-32的表达变化。实验分为空白组（N）、对照组（AF12h）、Laminarin组、AF12h+Laminarin组、N+DMSO组、AF12h+DMSO组、AF12h+CLI095组。在受到烟曲霉菌感染之前，AF12h+CLI095组角膜上皮细胞在1μg/ml CLI-095中预处理2小时以抑制TLR4，Laminarin组和AF12h+ Laminarin组角膜上皮细胞在0.3 mg/ml Laminarin中预处理30分钟以阻断Dectin-1，N+DMSO组和AF12h+DMSO组角膜上皮细胞在1μg/ml DMSO中预处理2小时。感染烟曲霉菌后12小时收集细胞，通过RT-PCR和Western Blot检测各组角膜上皮细胞中IL-32和TLR4的mRNA和蛋白质的表达水平。　　5. 实验分为正常人角膜组织组和真菌感染人角膜组织组。通过RT-PCR、免疫荧光染色法分别对正常角膜和真菌感染角膜中IL-32的mRNA和蛋白质的表达水平进行检测，通过免疫组织化学染色法检测真菌感染角膜中IL-32和PR3的蛋白质的表达。　　6. 实验分为正常角膜上皮细胞组和烟曲霉菌感染角膜上皮细胞组。培育烟曲霉菌并制成烟曲霉菌菌丝悬液，人角膜上皮细胞培养完成后由灭活的烟曲霉菌菌丝刺激液进行刺激，在刺激后的4、8、12和16小时分别收集细胞，通过RT-PCR、Western Blot和免疫荧光染色法对正常角膜上皮细胞和烟曲霉菌感染的角膜上皮细胞中PR3的mRNA和蛋白质的表达水平进行检测。　　7. 实验将烟曲霉菌感染的角膜上皮细胞分为对照组、重组人IL-32组、PMSF组和重组IL-32+PMSF组。重组人IL-32组角膜上皮细胞处理方法同前。在受到烟曲霉菌感染之前， PMSF组和重组IL-32+PMSF组将PMSF（蛋白酶抑制剂）1mM加入到角膜上皮细胞中作用6小时，感染烟曲霉菌后12小时收集角膜上皮细胞，通过RT-PCR和ELISA检测各组促炎症细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白质的表达水平。　　实验数据表示为平均数±标准差（SD），使用GraphPad 5.0软件进行数据分析。人角膜上皮的数据由未配对的双侧t分布检验确定，对细胞刺激的数据分析通过单因素方差分析方法来完成。P<0.05被认为有显著差异，具有统计学意义。　　结果：　　1. 在真菌感染的角膜组织中，通过RT-PCR检测的结果显示，IL-32的mRNA表达水平明显高于正常角膜中的mRNA水平（P<0.01）；免疫荧光染色法检测蛋白质的结果显示，真菌感染的角膜可见明显的阳性荧光染色，IL-32的蛋白质的表达明显高于正常角膜，而且显示IL-32在角膜上皮细胞膜和基质中的炎症细胞中均有广泛分布。　　2. 烟曲霉菌感染的角膜上皮细胞在感染后的4、8、12、16小时等4个时间点，通过RT-PCR检测的结果显示，IL-32的mRNA表达水平在感染后4小时明显高于正常角膜上皮细胞中的mRNA水平，并且在感染后8小时达到最高值（P<0.001）；Western Blot检测的结果显示，IL-32的蛋白质表达水平在感染后4小时明显高于正常角膜上皮细胞中的蛋白质水平，并且在感染后12小时达到最高值（P<0.001）。烟曲霉菌感染角膜上皮细胞后12个小时，通过免疫荧光染色法检测的结果显示，与正常角膜上皮细胞相比，IL-32阳性染色增多，并且IL-32在角膜上皮细胞的细胞核和细胞质中均有分布。　　3. 烟曲霉菌感染的角膜上皮细胞在感染后的0、4、8、12、16小时等5个时间点，通过RT-PCR检测的结果显示，与对照组相比，经过重组人IL-32预处理组角膜上皮细胞中的IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平在感染后4小时明显升高，并且在感染后8小时达到最高值（P<0.001），16小时开始略下降，但仍有统计学意义；ELISA检测的结果显示，与对照组相比，经过重组人IL-32预处理组角膜上皮细胞中的IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白质表达水平在感染后8小时明显升高，12小时或16小时达到最高值（P <0.001）。　　4. 烟曲霉菌刺激角膜上皮细胞后12小时，通过RT-PCR检测的结果显示，与AF12h+DMSO组相比，AF12h+CLI095组角膜上皮中的TLR4和IL-32的mRNA表达水平均降低（P<0.001）；但是空白组（N）与Laminarin组相比、对照组（AF12h）与AF12h+Laminarin组相比，IL-32的mRNA表达水平均未见明显差异。Western Blot检测的结果显示，与N+DMSO组相比，AF12h+DMSO组角膜上皮中的TLR4和IL-32的蛋白质表达水平均明显升高（P<0.001）；而与AF12h+DMSO组相比，AF12h+CLI095组角膜上皮中的TLR4和IL-32的蛋白质表达水平均明显降低（P<0.001）。　　5. 通过RT-PCR检测的结果显示，PR3的mRNA表达水平在正常人角膜组织组和真菌感染人角膜组织组之间未见明显变化；免疫荧光染色法检测的结果显示，PR3的蛋白质表达在正常人角膜组织组和真菌感染人角膜组织组之间未见明显变化；免疫组织化学染色法检测的结果显示，真菌感染的角膜组织中IL-32与PR3的蛋白质表达明显，呈棕黄色，主要位于角膜上皮细胞的细胞浆内；从免疫荧光染色检测和免疫组织化学检测的结果中可以看出PR3与IL-32一样，在角膜上皮细胞胞膜和基质中的炎症细胞中均有分布。　　6. 烟曲霉菌感染的角膜上皮细胞在感染后的4、8、12、16小时等4个时间点，通过RT-PCR检测的结果显示，PR3的mRNA表达水平在正常角膜上皮细胞组和烟曲霉菌感染角膜上皮细胞组之间未见明显变化；Western Blot检测的结果显示，PR3的蛋白质表达水平在正常角膜上皮细胞组和烟曲霉菌感染角膜上皮细胞组之间未见明显变化；免疫荧光染色检测的结果呈阳性染色，PR3与IL-32一样，在角膜上皮细胞的细胞核和细胞质中均有分布。　　7. 烟曲霉菌感染角膜上皮细胞后12小时，通过RT-PCR和ELISA检测的结果显示，与对照组相比，重组人IL-32组角膜上皮细胞中的促炎症细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白质的表达水平均显著升高（P<0.001），而与重组人IL-32组相比，重组IL-32+PMSF组角膜上皮细胞中的促炎症细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白质的表达水平均显著降低（P<0.001）。　　结论：　　1. IL-32在真菌感染的角膜组织中表达增高；重组人IL-32刺激的烟曲霉菌感染后的人角膜上皮细胞，促炎症细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白质水平表达增高，提示IL-32在真菌性角膜炎免疫反应中可能起着重要作用。　　2. 在真菌性角膜炎中，IL-32的表达是通过TLR4而不是Dectin-1介导的信号通路来调控的；IL-32还可能通过PR3信号通路参与真菌性角膜炎免疫反应。　　意义：　　本实验研究探讨了IL-32/PR3在真菌性角膜炎固有免疫中的作用，有助于揭示真菌性角膜炎关键的发病机制，并为真菌性角膜炎探索有效的治疗和干预手段提供新的理论依据和实验资料。