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福寿螺是一种外来入侵生物,原产于南美洲亚马逊流域,现遍布于我国长江以南15个省(直辖市、自治区)的各个作物区,对水生作物危害严重。福寿螺对逆境的适应能力极强,对高温、低温和寄主等能较快地作出适应,尤其是对低温的适应是福寿螺向北扩散的生物学基础。因此,福寿螺低温适应性机理的研究已成为生物学界关注的热点,但目前对福寿螺低温适应性以及入侵扩散的分子机理研究较少,因此对其扩散和危害的预防还缺少理论和实践依据。本论文以福寿螺主要入侵危害种类Pomacea canaliculata为研究对象,采用抑制消减杂交(SSH:suppression subtractive hybridization)、斑点杂交(dot blot hybridization),荧光定量PCR(qPCR)和RNA干扰(RNAi:RNA interference)等技术手段,从生理生化和分子生物学角度研究福寿螺对低温胁迫的响应,为预测和有效控制该有害生物的扩散奠定了理论基础。主要结果和结论如下:1.福寿螺越冬幼螺过冷却点(supercooling points,SCP)和低温胁迫研究表明,福寿螺越冬幼螺SCP与样本采集时的环境温度呈显著正相关,在最冷月(2月份)采集样本时的SCP达最低值。福寿螺过冷却点范围在-7.14℃～-6.74℃之间,平均值为-6.94℃。福寿螺越冬幼螺的低温耐受性随环境温度的降低而增强,且这种耐寒性可通过低温驯化得以提高。福寿螺SCP和结冰点(Freezing point)受其体型的影响,螺壳高在12.6-20.0mm的幼螺具有较低的过冷却点和结冰点,表明该生长期的福寿螺具有较高的耐寒性。2.福寿螺低温胁迫下抗氧化酶活性测定结果表明,抗逆相关的保护酶系统(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GPX)在防御逆境对机体的伤害中起着重要的作用。随着低温胁迫时间的延长,福寿螺肝脏SOD、GPX和CAT活力均逐渐上升,在胁迫12h时达到最大值,随后逐渐降低。MDA(丙二醛)含量也随低温胁迫时间延长而逐渐上升,24h达到最大值,之后,随着胁迫时间进一步延长,MDA含量逐渐降低,但仍显著高于对照组(P<0.05);Na+/-K+-ATPase酶活力随时间延长呈现先下降后上升的趋势,酶活力在胁迫24h时达到最低,其后酶活力有所升高,但在120h仍显著低于对照组(P<0.05)。低温胁迫下福寿螺体内SOD、CAT、GPX和Na+/-K+-ATPase的酶活力的变化以及MDA含量的的变化表明,上述几种酶参与了福寿螺低温胁迫应答过程,均可作为检测其应答低温胁迫的标志物。3.福寿螺越冬幼螺生理生化指标和代谢酶活性测定结果表明,福寿螺幼螺在越冬期的葡萄糖、甘油含量变化与过冷却点呈显著负相关,说明葡萄糖、甘油为越冬期福寿螺幼螺体内潜在的抗冻保护物质。糖原是福寿螺体内重要的能源物质,福寿螺越冬幼螺的糖原在越冬期大幅降低,越冬后期又恢复至越冬初期水平。越冬期间,幼螺含水率随着季节温度的下降而逐渐降低,含水率的最低值出现在平均温度为最低值的2月,随后,随着温度的回升而逐渐升高;福寿螺幼螺解除休眠,生理代谢作用逐渐增强,体内含水率逐渐上升。越冬期间,脂肪作为一种重要的能源储备,其含量先上升后下降。越冬期间福寿螺代谢酶(丙酮酸激酶PK,乳酸脱氢酶LDH,甘油激酶GK和三磷酸甘油脱氢酶GPDH)的活性变化存在季节性差异,丙酮酸激酶活性在越冬初期和越冬期显著增加,2月份达最大值,随后逐渐下降,5月份达到最低值。乳酸脱氢酶活性在10月份达最大值,进入越冬期后逐渐下降,翌年2月份最低,而后随着环境温度的升高而升高。甘油激酶和三磷酸甘油脱氢酶是生物体内甘油合成代谢的关键酶,9月份至1 1月份甘油激酶活性逐渐下降,12月份活性逐渐增加,翌年2月份达最大;三磷酸甘油脱氢酶活性在越冬期一直增强,翌年2月份达最大值,随后下降。这种季节性差异提示各个代谢酶在福寿螺幼螺体内可能具有调节耐寒能力的作用。4.构建了福寿螺幼螺低温胁迫SSH文库,利用反向Northern杂交筛选阳性克隆,共获得了 245条有效表达序列标签(EST)。对筛选到的245条EST进行拼接和聚类,共获得202条uniESTs。通过BlastX和BlastN分析,有95条ESTs序列与已知功能的基因序列相似,其余107条与未知功能的基因序列相似。对具有已知或推定功能蛋白的95条uniESTs进行blast2GO分析,初步明确95个uniESTs序列在细胞组件、分子功能和生物学途径中的作用,按功能将其分为抗逆性,糖类转运及代谢,能量运输、信号转导、转录后修饰和分子伴侣和酶活调控等。5.在ESTs分析基础上,利用半定量RT-PCR和qRT-PCR分析了差减文库中具有代表性的4个推定的与低温胁迫相关的差异表达基因,分别为HSP70(Heat shock protein70)、GK(Glycerol kinase)、GPDH(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)和 NKA(sodium/potassium-transporting ATPase)。结果显示,HSP70、GK、GPDH和NKA四个基因在低温胁迫下的表达量呈现规律性的变化,提示所选四个基因与福寿螺的低温耐受性有关,其整体表达模式与差减文库的筛选结果一致,表明SSH结果能够真实反映被检测基因的表达变化,结果准确可靠。6.利用RNAi技术和qRT-PCR对HSP70、GK、GPDH和NKA基因的功能进行研究。结果表明,注射靶基因的dsRNA能有效抑制福寿螺HSP70、GPDH、GK和NKA的表达,干扰后的福寿螺幼螺在低温胁迫下死亡率明显升高,表明福寿螺HSP70、GPDH、GK和NKA基因在调控幼螺耐寒性方面发挥着十分重要的作用。