云纹石斑鱼(Epinephelus moara)是东南亚最重要的水产养殖种类之一,主要分布在中国西北太平洋和沿海地区,是目前作为唯一用于制作刺身的石斑鱼种类,肉质细嫩、味道鲜美,具有极高的经济价值。超低温冷冻保存技术可为云纹石斑鱼石斑鱼种质资源的保存提供一个很好的途径。近年来,由于鱼胚体积大(直径为≥1mm)、双层膜、卵膜通透性差、卵黄囊含水量多,其冷冻保存比哺乳类胚胎困难许多。到目前为止,只有极少数品种的鱼胚能够成功冷冻保存。因此,加强鱼胚低温生物学的基础研究,对于阐明鱼类胚胎冷冻损伤机制,更好地制定相应的鱼胚冷冻保存方法,攻克鱼胚冷冻保存的技术难关具有重要作用。本文研究计划不同于以往大多数的鱼类胚胎冷冻研究路线,摒弃了对胚胎冷冻操作方法的单一摸索,采取三条技术路线相结合的策略。一方面利用传统玻璃化液PMG3S和PMG3T对云纹石斑鱼胚胎存活影响进行初步研究,分析不同玻璃化冷冻保存条件对云纹石斑鱼胚胎存活的影响,进行定向优化;另一方面,在传统玻璃化液研究的基础上,根据低温生物学领域的最新研究动向,研发新型非渗透性冷冻保护剂(NPC),并探究NPC在云纹石斑鱼胚胎冷冻保存中的应用;同时,利用转录组学技术比较胚胎冷冻成活组鱼苗与对照组鱼苗间的转录组差异,推测冷冻保存对鱼类胚胎的影响作用,分析冻存胚胎孵化鱼苗的表型与差异基因表达量之间的联系,为进一步挖掘石斑鱼胚胎冷冻损伤的相关基因,更好地保存水生种质资源提供有价值的参考。论文主体部分有四个章节:(1)玻璃化冷冻保护剂对云纹石斑鱼胚胎影响的初步研究本章主要研究了玻璃化液PMG3S和PMG3T对云纹石斑鱼胚存活的影响及其冷冻保存效果的初步实验。得出了云纹石斑鱼胚胎在玻璃化液处理后,可以继续进行冷冻保存的结论。结果显示,两种玻璃化液PMG3S和PMG3T均可用于冷冻保存实验,PMG3S处理组的胚胎存活率和正常发育率高于PMG3T组;18S期到ET期范围的胚胎可初步用于冷冻保存研究,TB期胚胎成活率最高。(2)玻璃化冷冻保存云纹石斑鱼胚胎方法的改良及条件优化本章基于上一章实验结论,进一步对多个时期胚胎(视囊形成期、肌节期、尾芽期、胚体抽动期、心跳期、孵化前期)在玻璃化液中的平衡时间(25-45min)、玻璃化液对胚胎体积影响、玻璃化液浓度(25-50%)、胚胎在两种有效玻璃化液(PMG3S和PMG3T)中适应性、冷冻前预冷温度(-5℃和4℃)和时间进行了筛选研究。结果显示,肌节期到胚体抽动期的胚胎成活率高,适于胚胎冷冻保存处理;随着平衡时间的延长,胚胎出现明显的脱水现象,30分钟更适于胚胎继续冷冻;浓度高于40%的玻璃化液会对胚胎造成显著伤害,35%-37.5%的玻璃化液更适于胚胎处理和冷冻保存;与PMG3T相比,PMG3S更适宜于胚胎冷冻保存;预冷处理能提高云纹石斑鱼胚胎冷冻前的存活率,但对冷冻后的存活率影响较小。经优化后,冷冻保存胚胎的平均存活率、正常发育率和畸形率分别为6.32%、2.36%和3.49%,平均孵化率为39.85%,较上一章(23.16%)提高72.06%,胚胎解冻后普遍存活时间短,个别孵化鱼苗出现眼部和尾部严重发育异常。(3)利用非渗透性冷冻保护剂冷冻保存云纹石斑鱼胚胎方法的研发作为首次采用非渗透性冷冻保护剂对石斑鱼胚胎进行超低温保存的初步研究,本章采用多因素多维筛选的方法,对石斑鱼胚胎进行了不同胚胎期、平衡时间、溶液浓度、胚胎载具、解冻温度和时间的筛选。结果显示,用1mol/L蔗糖溶液,5、6和7分钟的平衡时间,以及Cryotube II作为载具进行冷冻,然后在24℃解冻30秒,是可获得存活的16S和TB期的冷冻保存胚胎。本章共获得1195个冷冻成活胚胎,孵化鱼苗165尾,其中94尾鱼苗形态正常,最高孵化率达到41.28%。(4)云纹石斑鱼玻璃化冷冻成活胚胎孵化鱼苗的转录组测序分析本章评估了冷冻成活胚胎孵化鱼苗与对照组鱼苗转录本差异,基于GO和KEGG富集分析,给出了关于冷冻保存的胚胎解冻后存活时间普遍很短、无法发育至成鱼以及部分冷冻鱼苗出现严重的异常发育现象的合理解释。结果显示,冷冻保存过程中脱水/再水化或冻融可能损害了包括眼原基在内的中枢神经系统的发育,导致多个直接或间接介导光反应过程的基因和感光蛋白编码基因表达量出现显著降低,致使部分鱼苗的眼部晶体发育异常。多个与中枢神经系统的主要抑制作用相关的基因(glrb、gabrd、cacng3、gabra6)表达量出现明显下降,造成脑神经元突发性非正常放电,引起神经外胚层的基因表达的改变,导致鱼苗的Wnt信号通路、Notch信号通路、背腹轴形成通路中基因表达量异常,致使前索板中胚层的错误迁移,继而鱼苗后躯干畸形。