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植物内源sRNA(smallRNA,小RNA)在调控基因表达过程中起重要作用,它们可以通过激活或抑制特定基因的表达,从而影响植物的多个生物学过程。其中,sRNA在植物病原菌互作中的调控机制引起人们极大的关注。在植物多个类型的sRNA中,ta-siRNA(trans-acting RNA,反式作用干扰小RNA)通常是由22bp的miRNA(microRNA,微小RNA)靶定其同源基因的转录本后,经过DCL4(Dicer-like 4,Dicer切割酶4)切割而形成的小分子RNA。根据miRNA靶定剪切位点的差异,TAS基因转录本可产生一系列不同的ta-siRNA,双链ta-siRNA中的一条链与AGO蛋白(Argonaute Protein)结合形成 RISC(RNA-induced silencing complex,RNA诱导的沉默复合体),最终介导靶基因的降解。近年来,研究者根据天然sRNA的产生及作用机制,开发了人工合成的sRNA抑制病毒、真菌甚至昆虫的1个或多个目的基因的表达。真菌可触发多种危害严重、范围广泛的病害,真菌病害是植物病害中危害最大的一类,约占其70%-80%。研究表明灰霉病菌的sRNA可以进入植物寄主中攻击寄主的免疫通路。本研究以茄科植物与番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)互作体系为对象,研究在植病互作中,植物内源的sRNA是否可进入灰霉病菌,对其基因表达产生调控作用,从而帮助植物控制灰霉病菌的致病作用。此外,试图利用ata-siRNA(artificial ta-siRNA,人工合成的ta-siRNA)获得抗真菌病害的转基因植物。主要研究结果如下:1.选择茄科植物中不同类型的sRNA,以及跟茄科植物抗病相关的sRNA,以其反向互补序列作为靶定位点,插入携带有绿色荧光蛋白GFP的载体pNAH-OGG中;通过PEG介导的原生质体转化法将该载体整合到番茄灰霉病菌B05.10基因组中,经过表型、分子生物学及蛋白质方面的检测,获得了表达目的sRNA与GFP的转基因灰霉病菌,为研究茄科植物与番茄灰霉病菌的互作奠定了基础。2.利用灰霉病菌侵染实验,证明灰霉病菌可以使栽培烟草SumsunNN致病,并且探索了最佳的侵染阶段,为验证转ata-siRNA的烟草是否抗病奠定了基础。3.获得与灰霉病菌致病力相关的基因序列,根据序列的信息,通过基因合成技术设计构建了载体pH7LIC1.0-TAS和pAMIRgfp(对照为pAMIR54),能够表达靶定灰霉病菌重要基因的ta-siRNA;利用瞬时表达检测ata-siRNA,从而证明烟草体内可以表达ata-siRNA;将pH7LIC1.0-TAS和pAMIRgfp稳定转化烟草,获得了转基因烟草T0代,并杂交以上两种转基因烟草获得F1代;Northern Blot证明F1代可表达ata-siRNA;最后利用灰霉病菌侵染F1代,根据病斑的大小初步确定F1代烟草可降低灰霉病菌的致病作用。