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目的： 1.构建Zmp1慢病毒载体LV2-zmp1，用LV2-zmp1重组慢病毒感染巨噬细胞RAW264.7细胞，使Zmp1基因在巨噬细胞RAW264.7中稳定表达。 2.慢病毒LV2-zmp1感染巨噬细胞 RAW264.7，同时用雷帕霉素诱导自噬和羟氯喹抑制自噬，观察 Zmp1对巨噬细胞 RAW264.7自噬的影响。 方法： 1.以结核分枝杆菌基因组为模板，经PCR法扩增出锌离子依赖性金属蛋白酶1（Zmp1）基因，定向克隆至慢病毒表达质粒LV1获得Zmp1重组慢病毒表达质粒 LV1-zmp1。将慢病毒表达质粒 LV1-zmp1、重组穿梭质粒pGag/Pol、辅助包装质粒pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞进行病毒包装，转染72h后收集病毒液并进行滴度检测，得到滴度为1x108TU/ml的LV2-zmp1重组慢病毒。用LV2-zmp1重组慢病毒感染RAW264.7细胞，感染96h后采用荧光显微镜观察GFP表达反映病毒的感染情况；提取RAW264.7细胞总RNA，逆转录成cDNA，经RT-PCR检测 Zmp1基因在 RAW264.7细胞中的表达情况；提取RAW264.7细胞总蛋白，经Western blot法检测Zmp1蛋白在RAW264.7细胞中的表达水平。 2.慢病毒LV2-zmp1感染小鼠巨噬细胞 RAW264.7，同时用雷帕霉素诱导RAW264.7自噬和羟氯喹抑制RAW264.7的自噬，通过透射电镜观察自噬体形成数量，RT-PCR检测自噬相关基因Atg5、Atg8和Atg12的表达变化，Western blot法检测自噬相关蛋白BeclinI、LC3II和P62的表达变化来反映结核分枝杆菌的 Zmp1对小鼠巨噬细胞 RAW264.7自噬功能的影响。 结果： 1.成功构建慢病毒表达质粒LV1-zmp1；经四质粒共转染到293T细胞包装获得携带 Zmp1基因的重组慢病毒 LV2-zmp1；用重组慢病毒LV2-zmp1感染RAW264.7细胞，荧光显微镜观察到绿色荧光表达，RT-PCR法检测到Zmp1基因在LV2-zmp1感染的细胞中的高表达，Western blot法检测到Zmp1蛋白在细胞中的高表达。 2.雷帕霉素诱导 RAW264.7自噬后，与未表达 Zmp1的对照组相比，Zmp1重组慢病毒LV2-zmp1组在透射电镜下观察到自噬体数量出现明显减少；RT-PCR检测显示自噬相关Atg5、Atg8、Atg12基因的表达相应水平下调，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Western blot检测自噬相关蛋白BeclinI和LC3II表达下调，P62表达水平上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。经自噬抑制剂羟氯喹处理，Western blot检测自噬相关蛋白BeclinI和LC3II表达下调，P62表达水平上升，重组慢病毒LV2-zmp1组变化更明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 1.成功构建重组慢病毒载体 LV2-zmp1，该病毒载体可感染RAW264.7细胞并稳定表达Zmp1分子。 2.结核分枝杆菌Zmp1通过抑制自噬相关分子的表达、抑制自噬体的形成影响巨噬细胞的自噬功能。