癌细胞膜包覆纳米探针在三阴性乳腺癌分子影像诊断及治疗中的应用

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目的:三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌的高危亚型,易转移、难诊断、难治疗、预后差。为了实现TNBC的特异性靶向诊断,本研究构建了一种癌细胞膜包覆的上转换发光纳米探针,利用癌细胞膜的同源靶向性和免疫逃避能力,建立靶向TNBC小鼠模型的多模态分子影像诊断方法。方法:培养人源性TNBC细胞MDA-MB-231,经化学裂解与差速离心法得到MDA-MB-231癌细胞膜(Cancer cell membranes,CCm231);通过热分解法制备上转换发光纳米粒(Upconversion nanoparticles,UCNPs)Na Gd F4:Yb,Tm@Na Gd F4;通过机械挤压与电荷吸引使癌细胞膜包覆于上转换发光纳米粒表面,得到探针CCm231-UCNPs。动态光散射与透射电镜鉴定纳米探针的水合粒径与结构,SDS-PAGE与Western blot检测探针的膜表面蛋白标志物,CCK-8法检测细胞毒性。将探针与细胞共孵育后进行激光共聚焦显像,检测其体外同源靶向性与免疫逃避能力。将CCm231-UCNPs分别注射入MDA-MB-231(TNBC细胞)与MCF-7(非TNBC细胞)荷瘤鼠体内,进行UCL与MRI显像。在探针表面连接叠氮基团,体外合成18F标记的DBCO,提前24小时向小鼠体内注射纳米探针,通过预定位技术与叠氮和DBCO基团之间的点击化学反应进行PET显像与18F生物分布研究。使用电感耦合等离子体原子发射光谱法测定Gd3+生物分布情况。连续30天监测CCm231-UCNPs对小鼠的生物毒性。结果:CCm231-UCNPs水合粒径为190.47±6.67 nm,透射电镜下可见明显壳-核结构,SDS-PAGE与Western blot显示癌细胞膜包覆前后膜表面蛋白标志物不变,且均无细胞质与细胞膜标志物。浓度高达500μg/m L CCm231-UCNPs和UCNPs与MDA-MB-231细胞孵育24小时后仍无明显细胞毒性。激光共聚焦显像中,MDA-MB-231细胞对CCm231-UCNPs的摄取明显高于其他细胞,小鼠巨噬细胞Raw264.7对CCm231-UCNPs无明显摄取,证实探针的体外靶向性与免疫逃避能力。通过UCL显像确定最佳显像时间是注射CCm231-UCNPs探针24小时后;在UCL、MRI及PET显像中,CCm231-UCNPs组肿瘤摄取最高,且肝、脾摄取明显低于未包膜探针组;MDA-MB-231荷瘤鼠对CCm231-UCNPs的肿瘤摄取明显高于MCF-7荷瘤鼠。18F标记纳米探针生物分布结果显示,注射后4小时,MDA-MB-231组肿瘤摄取(4.05±0.50%ID/g)显著高于MCF-7组(1.20±0.14%ID/g)(P<0.001)。Gd3+生物分布结果显示,UCNPs组荷瘤鼠肝、脾摄取分别是CCm231-UCNPs组的1.82、1.79倍(分别为P<0.001,P<0.05);MDA-MB-231荷瘤鼠对CCm231-UCNPs的肿瘤摄取是MCF-7组的2.70倍(P<0.001),以上数据均具有显著统计学差异。通过监测小鼠生活状态、体重、血常规、血生化及主要器官H&E染色,验证了CCm231-UCNPs在30天内对小鼠无明显生物毒性。结论:本研究成功构建了癌细胞膜包覆的上转换发光纳米探针CCm231-UCNPs,体内、外实验均验证了其同源靶向性与免疫逃避能力,成功进行了荷瘤鼠在体UCL/MRI/PET多模态显像,并通过显像鉴别了TNBC与非TNBC这两种不同亚型乳腺癌小鼠模型。毒性实验验证了CCm231-UCNPs无明显细胞或全身生物毒性。本研究成功应用多模态分子影像技术,联合仿生医学与纳米医学,实现了TNBC早期、特异性诊断,并为肿瘤分子分型的无创影像提供了新的方向。目的:TNBC病人由于缺乏ER、PR和HER2的表达,对内分泌治疗和生物靶向治疗效果差。化疗为TNBC常用的治疗方法,但是在治疗过程中,病人极易产生抗药性,影响治疗效果。为了改善TNBC的治疗效果,本研究构建了癌细胞膜包覆的载氧纳米探针CCm-HSA-ICG-PFTBA,通过癌细胞膜的同源靶向性与免疫逃避能力,靶向肿瘤组织递送氧气,改善肿瘤组织缺氧情况,以期提高光动力学治疗效果,抑制肿瘤生长。方法:通过超声将全氟三丁胺(Perfluorotributylamine,PFTBA)与HSA和ICG均匀混合,包覆癌细胞膜,得到CCm-HSA-ICG-PFTBA。通过紫外分光光度计检测光学性质。经808 nm激发光激发后,通过单线态氧探针和活性氧探针体外检测单线态氧和活性氧含量变化。小动物荧光显像确定CCm-HSA-ICG-PFTBA探针到达肿瘤部位时间,通过18F-氟硝基咪唑(18F-fluoromisonidazole,18F-FMISO)PET/CT显像与肿瘤组织缺氧探针免疫荧光染色切片显像监测肿瘤部位缺氧情况。注射探针24小时后用808 nm激发光照射,对荷瘤鼠模型进行PDT,每天观察小鼠生活状态,称量体重,测量肿瘤长、宽,计算肿瘤体积;第14天使小鼠安乐死,取肿瘤称重;取小鼠血液做血常规、血生化检测,取重要器官做H&E染色,监测生物毒性。结果:CCm-HSA-ICG-PFTBA粒径为131.3±1.08 nm,最大吸收波长为790 nm,与ICG(780 nm)基本一致;黑暗中储存至60小时光稳定性佳。体外单线态氧检测结果显示,CCm-HSA-ICG-PFTBA组荧光强度上升最快,经808 nm激发光激发60秒后,荧光强度达到224181±2669,显著高于无PFTBA的HSA-ICG组(115495±1117)和超纯水对照组(76603±579)(均P<0.001);体外活性氧含量检测结果显示,经808 nm激发光激发,CCm-HSA-ICG-PFTBA组绿色荧光最强,活性氧含量最高。小动物荧光显像结果显示注射探针24小时后为最佳显像时间点。18F-FMISO PET/CT显像与肿瘤组织缺氧探针荧光染色切片显像结果显示,注射探针24小时后肿瘤缺氧情况明显改善。对荷瘤鼠进行PDT后第14天,CCm-HSA-ICG-PFTBA组肿瘤相对体积(6.73±0.6)明显小于HSA-ICG组(13.95±2.69,P=0.01)和未治疗的生理盐水对照组(16.28±4.89,P<0.001),治疗效果明显。通过监测小鼠生活状态、体重、血常规、血生化及器官H&E染色切片,验证了CCm-HSA-ICG-PFTBA无明显生物毒性。结论:本研究成功构建了癌细胞膜包覆的载氧纳米探针CCm-HSA-ICG-PFTBA,利用癌细胞膜的同源靶向性,可精准递送氧气至肿瘤组织,改善了肿瘤缺氧微环境,提高了光动力学治疗效果,减缓了肿瘤生长。毒性实验验证了该探针无明显细胞或全身生物毒性。该载氧探针所用材料均已由FDA批准可用于临床,具有良好的生物相容性和转化前景,为解决TNBC治疗抗药性及联合治疗方案的选择提供了新的转化方向。
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