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1、目的术后瘢痕是手术常见的并发症之一,在腰椎术后患者,硬膜外瘢痕的形成是腰椎手术失败综合征(FBSS)的重要成因之一。瘢痕的形成是创伤修复的结果,其形成伴随着炎性细胞浸润、成纤维细胞增殖分化、毛细血管形成、肉芽组织生成、胶原纤维形成沉积,等一系列复杂的过程。而成纤维细胞是瘢痕形成的主要效应细胞,所以对成纤维细胞生物学功能的调控对于控制瘢痕的形成显得尤为重要。虽然人们对其病因及治疗作了大量研究,但至今仍未获得有效的治疗手段。随着基因工程技术迅猛发展,使得基因治疗成为医学领域全新的治疗手段,特别是前几年才被发现的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,为分子医学带来翻天覆地的变化。本文将采用以慢病毒为载体的RNAi技术,从基因治疗的角度,以体外培养的小鼠成纤维细胞NIH3T3为研究对象,探索病理性瘢痕基因治疗的新策略。2、方法培养小鼠NIH3T3细胞,用MOI(感染复数)=10,30,50的GFP LentiviralParticles感染NIH3T3细胞,转染1周后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况,从而判断慢病毒载体转染目的细胞所需的合适MOI值及GFP表达时间。确定了LV载体转染目的细胞合适的MOI值后,以此条件进行目的基因的转染。用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞。分别以RT-PCR、Westen blot及MTT(四基噻唑基四唑)法来检测转染后细胞mRNA、蛋白质表达及细胞增殖水平的差别,以探讨慢病毒载体转染对目的细胞活力的影响。3、结果1)光显微镜观察结果：a)对于实验中的NIH3T3细胞,GFP表达随MOI值的增大而变强。其中MOI=30时GFP表达已比较满意。b)总体上,LV-eGFP转染细胞4天后GFP表达已接近高峰。2)PCR及Westen blot检测结果串珠素mRNA和蛋白质水平在shRNA组低表达,在对照组和GFP组高表达,shRNA组与对照组比较,shRNA组与GFP组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),对照组与GFP组比较差异无统计学意义。2)MTT法染色细胞计数结果：在DMEM/F12培养液培养下,对照组与GFP组细胞增殖接近正常,但shRNA组细胞的增殖与GFP组和对照组相比明显减低。4、结论通过本实验掌握了慢病毒载体转染目的细胞相关的实验方法。对于本实验NIH3T3细胞,MOI=30比较合适,已能达到有效转染；转染后4天GFP表达己接近高峰；串珠素shRNA慢病毒转染可以有效抑制小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞增殖能力。