水溶性聚噻吩荧光探针制备及其应用性能的研究

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水溶性荧光共轭聚合物,具有优异的发光性能和良好的生物相容性,目前在生物传感方面取得了很大的研究进展。其中,水溶性聚噻吩作为一种重要的荧光共轭聚合物,被广泛地应用在生物荧光探针检测中。  本论文合成了两种中间体2-(3-噻吩基)-对甲苯磺酰乙醇(以下简称中间体1)、(S)-3-[2-(噻吩)-乙氧基]-2-叔丁氧羰基丙酸(以下简称中间体2)以及水溶性聚噻吩衍生物聚(3-[(S)-5-氨基-5-羧基-3-戊氧基]-2,5-噻吩氯化物(以下简称POWT),借助核磁共振氢谱(1H-NMR)、傅立叶红外光谱(FT-IR)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)和荧光发射光谱(PL)对化合物的结构进行了确认与表征。  借助紫外-可见吸收光谱法(UV-Vis)和荧光光谱法(PL)对中间体1,中间体2和聚合物POWT的光学物理性能进行了探究,研究结果表明中间体1和中间体2的最大紫外吸收波长(λmax)分别位于244nm和248nm处,最大荧光发射峰(λem)分别位于423m和419nm处,发出明亮的蓝光。而聚合物POWT在402nm处出现最大紫外吸收峰,在560nm处出现最大荧光发射峰,紫外灯下POWT发出明亮的橘黄色。采用“等吸点激发、校正荧光积分面积法”测定了POWT的相对荧光量子产率,结果表明其相对荧光量子产率较低。  通过荧光光谱进行了如下研究:(1)对测试所用的POWT-缓冲溶液的pH、NaCl浓度以及缓冲溶液的组成进行了最优化选择,得出以下结论:在pH为8.4,CNaCl=0.2M时,POWT在缓冲溶液中的荧光发射光谱强度最大。Tris作为一种缓冲溶质,能够将POWT-缓冲溶液的荧光强度淬灭,向缓冲溶液中加入少量的表面活性剂Triton-X-100可以使得溶液的荧光强度恢复到POWT在纯水中的强度,从而有效提高了检测灵敏度;(2)探究了POWT对与乳腺癌和卵巢病变相关的基因片段BRCA1和TB4 ssDNA的响应性能,解释了造成聚合物荧光变化和光谱波长移动的原因。向聚合物溶液中加入BRCA1或TB4-1 ssDNA时,POWT溶液的荧光发生猝灭,且最大发射波长红移,且随着ssDNA浓度的增加,荧光淬灭率上升,最大荧光猝灭率分别可达62.98%和48.71%。当加入ssDNA浓度在1.0×10-11M~1.0×10-9M内,体系的荧光强度比值I0/I与ssDNA的浓度关系符合Stem-Volmer方程。其中,在1.0×10-11M到5.0×10-11M范围内,I0/I与ssDNA的浓度呈线性关系,线性方程分别为I0/I=8.254×109C+1(R2=0.9999)和I0/I=6.924×109C+1(R2=0.9999)。淬灭常数KsV分别为8.254×109M-1和6.924×109M-1,对于BRCA1和TB4两种ssDNA序列的最低检测限(LOD)分别为2.2×10-12M和2.7×10-12M;(3)探究了POWT-ssDNA组成的复合荧光探针对于含不互补碱基的ssDNA序列的识别性能。经研究发现,当向POWT-ssDNA体系中加入完全互补的ssDNA序列后,经过退火杂交,荧光恢复到POWT未加任何DNA的强度。若加入的互补的ssDNA中有1~3个不匹配的碱基,荧光强度只能部分恢复,且不匹配的碱基个数越多,荧光强度恢复的程度越低,证明设计的荧光探针具有较高的选择性。此种方法将有可能应用于临床检测BRCA1和TB4基因的突变;对POWT分子和两种ssDNA分子的作用的模式进行了估定。得出POWT分子的链长小于两种DNA的链长,但是POWT的分子数多于DNA的分子数,一个DNA分子可能与2~3个POWT分子结合。(4)探究了POWT对于不同长度的BRCA1和TB4 ssDNA的响应性能;通过分析研究结果,推测影响淬灭率可能有以下两方面的原因,第一,碱基数的差异。ssDNA含有的碱基数越多,与POWT发生π-π堆叠的环状结构分子越多,堆叠作用越强,POWT荧光淬灭程度越高,△I/I越高;第二,对于碱基数相近的ssDNA,含有的嘌呤数和嘧啶数不同,淬灭效应也不同。一般来说,若含有的嘌呤数的比例多于嘧啶数,则ssDNA分子中含有一个五元环和一个六元环的分子多于仅含有一个六元环的分子,与POWT发生π-π堆叠作用也相对较强,POWT荧光淬灭程度越高,△I/I越高。
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