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第一部分急性病毒性心肌炎患者外周血CCL20与Th17细胞表达及相关性研究背景：急性病毒性心肌炎(AVMC)是心血管内科常见感染性疾病,其病理改变主要为炎症细胞浸润心肌组织。多种固有免疫细胞和获得性免疫细胞如淋巴细胞、巨噬细胞等均参与急性病毒性心肌炎的病理过程。其分泌的抗心肌抗体、细胞因子等介导的自身免疫性反应是造成心肌组织损伤和心肌功能改变的主要原因。Th17细胞是由CD4+T细胞分化而成的辅助性T细胞亚群,其特征性分泌IL-17细胞因子,参与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、哮喘等多种自身免疫性疾病和炎症反应的发生发展过程。趋化因子CCL20又称巨噬细胞炎性蛋白(MIP3a),多种免疫细胞均可分泌CCL20参与机体炎症反应。研究发现CCL20参与银屑病、风湿性关节炎、炎症性肠病、肿瘤免疫等多种疾病的病程进展,同时病毒感染后CCL20的水平升高。因此,我们对急性病毒性心肌炎患者外周血CCL20与Th17细胞表达进行研究,探讨两者在病毒性心肌炎中的可能作用及两者间的关联。实验方法：收集2010.06至2013.06急性病毒性心肌炎住院患者30例,同时招募30名年龄相仿、性别比例相似的健康志愿者作为对照。清晨采集肘静脉血(空腹),使用肝素钠溶液进行抗凝,通过酶联免疫吸附试验(ELISA实验)法检测急性病毒性心肌炎患者和健康志愿者外周血CCL20和IL-17的水平；同时,利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,然后使用流式细胞学技术检测Th17细胞占外周血CD4+T细胞比例,进而对急性病毒性心肌炎患者外周血CCL20水平及Th17细胞比例进行相关性分析。实验结果：AVMC患者外周血CCL20水平较健康志愿者明显升高,AVMC患者组血浆CCL20浓度为(11.76±3.61)ug/L,健康志愿者组血浆CCL20浓度为(2.78±0.64)ug/L, P<0.05。AVMC患者外周血IL-17水平及Th17细胞比例均高于健康志愿者：AVMC组血浆IL-17水平为(95.6±-19.8)ng/L,健康志愿者组血浆IL-17水平为(9.7±4.7)ng/L,P<0.05；外周血Th17细胞占CD4+T细胞比例AVMC患者为(1.52±0.86)%,健康志愿者为(0.24±0.17)%,P<0.05。相关性分析提示AVMC患者外周血CCL20水平与Th17细胞比例呈正相关,R=0.78,p<0.01。结论：急性病毒性心肌炎患者外周血CCL20水平、IL-17水平和Th17细胞比例均较健康志愿者明显升高,且急性病毒性心肌炎患者外周血CCL20水平与Th17细胞比例呈正相关。第二部分急性病毒性心肌炎中CCL20对Th17细胞趋化作用研究背景：固有免疫细胞巨噬细胞可以分泌趋化因子CCL20；而Th17细胞可以组成性表达CCL20的特异性受体CCR6,但CCL20对Thl7细胞的作用尚不明确。siRNA为人工合成的小分子双链RNA,可以与靶基因mRNA特异性结合,阻断mRNA的翻译过程,使靶基因表达沉寂。为了探讨急性病毒性心肌炎中CCL20对Th17细胞的作用及机制,本研究分离急性病毒性心肌炎患者外周血巨噬细胞和Th17细胞,采用siRNA技术抑制巨噬细胞CCL20的合成,通过Transwell小室共培养巨噬细胞和Th17细胞,检测CCL20对Th17细胞的趋化作用。实验方法：分离AVMC患者外周血巨噬细胞,并将这些细胞分为三组,接种于12孔板(1)转染siCCL20RNA组,(2)转染scramble siRNA组,(3)无转染对照组。通过酶联免疫吸附实验法,分别检测三组细胞的培养上清中的CCL20含量。使用磁珠分选试剂盒分离纯化AVMC患者外周血CD4+T细胞和Th17细胞。巨噬细胞和CD4+T细胞共培养：将CD4+T细胞放入Transwell小室上室内,趋化8h,收集趋化至下室的细胞,通过流式细胞学方法检测下室细胞中Th17细胞比例及CCR6+IL-17+双阳性细胞比例。巨噬细胞和Th17细胞共培养：将FITC-CD4单抗标记的人Th17细胞悬液加入Transwell小室上室,与巨噬细胞共培养8h后移除Transwell小室上室,在荧光显微镜下观察下室Th17细胞数目；将Th17细胞悬液加入Transwell小室上室,与巨噬细胞共培养24h后利用实时定量PCR法检测趋化至下室的细胞中CCR6mRNA的相对表达量。实验结果：转染CCL20siRNA的巨噬细胞分泌CCL20量明显低于转染scramble siRNA组和无转染组,转染scramble siRNA组和无转染组间无明显差异。流式细胞学检测转染CCL20siRNA组趋化至下室的Thl7细胞比例(6.86±0.59%)及CCR6+IL-17+双阳性细胞比例(2.56±0.78%)均低于转染scramble siRNA组(9.14+0.82%,4.12±0.43%)和无转染组(9.74±0.77%,4.55±0.84%),p<0.05,转染scramble siRNA组和无转染组间无明显差异。荧光显微镜下观察,转染CCL20siRNA的巨噬细胞下室Th17细胞数量为每视野(35±6.2)个,明显低于转染scramble siRNA组(86±9.6)和无转染组(80±10.1),p<0.05；转染scramble siRNA组和无转染组间无明显差异。转染CCL20siRNA组下室Thl7细胞CCR6mRNA的相对表达量(0.36±0.08)明显低于转染scramble siRNA组(0.88±0.17)和无转染组(1.0±0.15),p<0.05；转染scramble siRNA组和无转染组间趋化至下室的细胞CCR6mRNA表达无明显差异。结论：转染CCL20siRNA后可以有效抑制巨噬细胞表达CCL20。 CCL20对Th17细胞具有趋化作用,CCL20可以促进Th17细胞高表达CCR6。