兰科植物Orchidaceae是典型的菌根植物。菌根共生真菌已被证实是其人工栽培、引种驯化、资源再生及保护的关键限制性因子。附生兰科植物约占兰科植物种数的69%。然而与地生兰科植物相比,附生兰科植物的菌根共生研究相对缺乏。石斛属植物Dendrobium是附生兰科植物的第二大类群,集观赏和药用价值为一体,其资源保育和可持续利用已成为普遍关注的焦点。华石斛(Dendrobiumsinense Tang et Wang),海南特有濒危种,仅分布于海南岛中西部山区。研究华石斛的菌根生物学是有效利用其共生真菌资源的前提,在维持物种多样性和园艺栽培、药用生产方面都有着重要意义,目前还缺乏对其菌根生物学的系统研究。本课题开展华石斛D.sinens 的菌根生物学研究,从菌根内生真菌多样性、菌根形态与结构、种子室内共生萌发、共生体系的建立和对干旱胁迫的生理响应等方面,讨论菌根共生关系的多样性、专一性和共生机制。研究结果可以帮助理解华石斛菌根共生的内在机制,也可为附生兰科植物资源的保育和可持续利用提供案例。主要研究成果与创新点如下:1.华石斛菌根内生真菌的多样性探索华石斛的2个偏好性附生树种(碎叶蒲桃、毛棉杜鹃)、2个非偏好性附生树种(碟斗青冈、竹叶松)与华石斛根部菌根内生真菌多样性的相关性。结果发现:(1)从36棵附生树上的华石斛根部中,共分离得到421株内生真菌,鉴定得到56个 OTUs(Operational Taxonomic Units),71 株类丝核菌归属于 7 个 OTUs,均属于胶膜菌科 Tulasnellaceae;炭角菌科 Xylariaceae 真菌(25 OTUs,RF=27.79%)是华石斛根部内生真菌的最优势类群,木霉属Trichoderma、弯颈霉属Tolypocladium、炭角菌属Xylaria和拟盘多毛孢属Pestalotiopsis是优势属;(2)分离自华石斛根部的菌根内生真菌群落,其物种丰富度和多样性受到附生树种的强烈影响;物种丰富度和多样性指数的分析都表明,附生在碎叶蒲桃Syzygium buxilium上的华石斛根部菌根内生真菌多样性程度最高;(3)群落成分分析表明,胶膜菌科Tulasnellaceae真菌是附生在碎叶蒲桃和毛绵杜鹃上华石斛根部的优势类群,在另外两种附生树上则不常见;(4)说明菌根内生真菌的多样性能够反映华石斛的附生偏好性,为附生树种导致附生兰科植物菌根内生真菌的差异提供了证据。2.华石斛菌根的形态与结构通过石蜡切片和光学显微技术,以华石斛野生植株和菌根化组培苗为对比,观察华石斛菌根的形态解剖结构特征、菌根真菌侵入方式及在菌根内的分布和消长状况。结果发现:(1)华石斛根的横切面包括根被、皮层和中柱,外皮层分布有通道细胞;野生菌根与组培苗根的基本结构无明显区别,主要差异在于根中是否有入侵的真菌;(2)华石斛菌根是典型的附生兰科植物菌根,菌根真菌通过通道细胞侵入皮层细胞,菌丝的不断入侵和消解为华石斛生长提供营养,可同时观察到丝状菌丝、菌丝团和菌丝团残片3种不同形态的菌丝;(3)供试的7个胶膜菌科Tulasnellaceae菌株能与华石斛建立共生关系,是真正的菌根真菌;(4)菌根化组培材料的菌根真菌总侵染率以及丝状菌丝与菌丝团的侵染率,都显著高于野生菌根材料,但是菌丝团残片的侵染率显著低于野生菌根材料,说明在组培条件下,菌根真菌更容易侵染华石斛营养根。3.华石斛种子的室内共生萌发以野生华石斛种子为材料,与已被确认是华石斛真正的菌根真菌的7个胶膜菌科Tulasnellaceae菌株,在燕麦培养基上进行室内共生萌发试验。结果发现:(1)播种16周后,非共生萌发的华石斛种子停留在阶段1-2,7个供试菌株均能成功侵染华石斛种子,并且不同程度地促进种子萌发;(2)除了 Tul-07以外,供试菌株均能促进种子进入阶段3或以上的萌发进程,其中,Tul-06处理的种子总是率先进入更高阶段,Tul-01与Tul-04处理的种子进入了阶段4,只有Tul-06与Tul-03处理的种子进入了阶段5;(3)总萌发率TGR、萌发率指数GRI和生长指数GI的分析结果表明,胶膜菌属Tulasnella sp.菌株Tul-06对华石斛的种子萌发与原球茎发育表现出最显著的促进效果,Tul-03次之,Tul-07的促进效果最差;(4)说明在室内条件下,华石斛种子能够与胶膜菌科菌根真菌形成共生关系,并且不存在严格的专一性,菌株Tul-06能同时显著促进种子萌发与原球茎发育,说明也不存在阶段专一性。4.华石斛菌苗共生体系的建立建立华石斛组培苗与菌根内生真菌共生体系,对比混接内生细菌对菌苗共生体系的影响,筛选促生真菌菌株和促生“真菌+细菌”组合。结果发现:(1)改良DE培养基上的组培苗与菌根内生真菌的共生关系更和谐,是合适的共生培养基;(2)以基本生物量鲜重、分蘖和生根为指标,筛选出8个促生真菌菌株:胶膜菌科Tulasnellaceae sp.菌株 Tul-02、Tul-05、Tul-07,镰刀菌属Fusari m sp.菌株 Fus-01、乳孔菌属Theleporus sp.菌株 The-01 和木霉属Trichoderma sp.菌株 Tri-01、Tri-02、Tri-03,其中,Tul-07和Tri-01能够极显著地促进华石斛组培苗生长;(3)8株促生内生真菌与3株促生内生细菌平板对峙时,24种组合中筛选出10个非拮抗组合;菌苗共生培养后,筛选出4 个促生组合 Tul-05+Bac-01、Tul-07+Bac-01、Fus-01+Ser-01 和 Tri-01+Bac-01;(4)最优促生组合Tul-07+Bac-01和Tri-01+Bac-01能够不同程度地促进华石斛吸收矿质元素(N、P、K、B、Fe、Mn)、提高光合性能(叶绿素a含量、叶绿素b含量、净光合速率、气孔导度)和调节内源激素(IAA、GA3、ABA含量),并且分别在部分指标上表现出协同效应;(5)说明内生真菌和内生细菌的双重混合接种可以促进兰科植物的生长,细菌菌株Bac-01(韦氏芽孢杆菌Bacillus weihenstephanensis)可能是华石斛的菌根促生细菌MHB,并且对合作真菌没有表现出严格的专一性。5.华石斛共生苗对干旱胁迫的生理响应通过PEG模拟干旱胁迫,以不同接菌处理的华石斛共生苗为对比,观察干旱条件下的植株形态变化,比较分析相关生理指标的差异。结果发现:(1)华石斛组培苗植株的根部形态与结构发生变化:叶绿素减少、产生假根毛(Rhizoids)、根被组织增加2-3层细胞等;(2)华石斛植株的光合性能指标(总叶绿素含量、净光合速率、气孔导度)大小、渗透调节物质(脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白质)含量以及抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性高低与植株抗旱能力呈正相关,膜透性指标(细胞质膜相对透性、MDA含量)大小与植株抗旱能力呈负相关;(3)说明干旱胁迫能使华石斛根部结构发生适应性变化,抑制植株的光合性能,损害细胞膜透性,导致渗透调节物质含量和抗氧化酶活性的上升,而且胁迫时间越长,效果就越明显;(4)单接真菌处理Tul-07与Tri-01只能显著提高华石斛共生苗的鲜重增长,不能显著提高抗旱能力,“真菌+细菌”混接组合Tul-07+Bac-01和Tri-01+Bac-01处理能显著提高华石斛共生苗的抗旱能力;(5)相关生理指标分析表明:2个混接组合Tul-07+Bac-01和Tri-01+Bac-01能够不同程度地缓解干旱胁迫对华石斛植株光合性能的抑制,降低细胞膜透性指标,提高渗透调节物质累积含量和抗氧化酶活性,说明潜在的菌根促生细菌MHB菌株Bac-01(韦氏芽孢杆菌Bacillus weihenstephanensis 能够协助菌根内生真菌提高华石斛组培苗的抗旱能力。