目的：　　 矽肺是由于在生产过程中长期吸入游离二氧化硅含量较高的粉尘（矽尘）而引起的以肺组织纤维化为主的全身性疾病，是最主要的尘肺病类型。矽肺患者常伴发各种自身免疫性疾病，进一步加剧矽肺的发生发展。矽肺的发生发展是一种慢性炎症过程，也是由Th1型向Th2型免疫应答极化的过程。矽尘进入肺内，激活肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AMs)释放大量的细胞因子，募集中性粒细胞至肺组织。此时T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ等Th1型细胞因子，肺内逐渐形成细胞性结节。矽结节经历细胞性结节、纤维细胞性结节、细胞纤维性结节，最终转化为纤维性结节过程中，矽肺逐渐由肺泡炎期过渡到纤维化期。此时T淋巴细胞主要分泌IL-4、IL-5等Th2型细胞因子，调控纤维母细胞的分化以及成纤维细胞的趋化作用、增殖及胶原的合成，同时抑制Th1型免疫反应。Th17(T helpertype17)细胞是以表达IL-17A为特征的新CD4+T细胞亚群，介导炎症反应、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等的发生和发展，特别是与机体自身免疫病的发生关系密切。在TGF-β和IL-6的共同作用下，初始T细胞向Th17细胞分化，表达孤核受体（Orphan nuclear receptor，ROR-γt）和IL-23受体(IL-23R)等。IL-23R和IL-23对Th17细胞存活、扩增和其介导炎症和自身免疫发生起重要调节作用。IL-1β可促进Th17细胞分化。IL-17A是Th17细胞的标志性因子，可诱导其它炎症细胞因子的表达，上调趋化因子和胞质金属蛋白酶，引起炎症细胞浸润和组织损伤;同时IL-17A可参与中性粒细胞的增殖、成熟和趋化，并能促进树突细胞成熟。在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎病人中IL-17A表达均升高;肺囊性纤维化和慢阻肺的病人IL-17A的表达较正常对照组增加。以上结果提示在矽尘诱发的自身免疫中Th17型免疫应答也可能存在并起重要作用。　　 为探讨IL-17A/Th17在矽肺发生发展中诱发自身免疫的机制，我们用矽尘建立IL-17A中和小鼠矽肺纤维化模型，确定在矽尘诱发自身免疫发生的过程中Th17数量和活化特点，分析IL-17A/Th17对Th1/Th2免疫应答建立时效特征和效应差异，旨在为寻求防治疾病新靶点提供新的实验和理论依据。　　 实验方法：　　 一、应用抗体中和小鼠体内的IL-17A　　 C57BL/6小鼠（6-8w龄，雌性）经腹腔注射100μg anti-IL-17A Ab，中和小鼠体内IL-17A，建立SiO2抗体组模型。SiO2模型组、对照组C57BL/6小鼠腹腔注射等体积的IgG1抗体。SiO2抗体组、SiO2模型组、对照组C57BL/6小鼠分别行暴露式气管内注入法灌注二氧化硅颗粒悬液和生理盐水。将各组动物分别于7，28，56天处死，收集BALF;收集肺门淋巴结、脾组织，用于制备细胞悬液。摘取肺脏，-80℃保存。　　 二、ELISA检测血清中自身抗体水平　　 ELISA试剂盒测定小鼠血清中ANA和抗-dsDNA抗体的浓度。测定前将血清稀释100倍。每孔分别加入100μl不同浓度标准品（制作标准曲线）或稀释后的样本，室温孵育1h，弃去板中液体，PBS清洗四次，加入抗小鼠免疫球蛋白-辣根过氧化物酶100μl，室温孵育30min，弃去板中液体，PBS清洗五次，加入底物TMB100μl，室温避光孵育15min，加入100μl终止液，450nm处读板。　　 三、炎性细胞分类计数　　 将各组动物各个时间点收集的BALF1500rpm，4℃，离心10min，收集细胞，制备单细胞悬液，取10μl细胞悬液置于细胞计数板上，进行细胞计数。细胞数=(四个大格的细胞总数/4)×104。取400μl细胞悬液，室温1500rpm离心8min，弃上清，加入200μl小牛血清混匀，推片，室温晾干，用甲醇固定，37℃温箱过夜，用Giemsa染液染色，室温15min;蒸馏水背冲，晾干。油镜下计数200个细胞中巨噬细胞，中性粒细胞，淋巴细胞的数量。　　 四、流式细胞技术　　 脾和肺门淋巴结细胞悬液细胞计数后，取0.1ml（106细胞），应用CD4-PerCP-Cy5.5、IL-17A-PE检测Th17细胞。PMA刺激细胞4-5小时后，加入离子霉素和莫奈霉素，用rat anti-mouse CD16/CD32封闭FcRs。加入预冷的固定液，4℃避光孵育30min，3％FBS的PBS清洗细胞两次，加入37℃预热的破膜液，37℃避光孵育细胞30min，再次清洗细胞两次，应用PerCP-Cy5.5标记的CD4抗体、PE标记的IL-17A抗体室温避光孵育细胞30min，进行胞内染色。清洗后，加入1％多聚甲醛的PBS300μl，混匀，流式细胞仪检测。FACSCanto（II）流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC、anti-CD4-PerCP-Cy5.5定义CD4+T细胞，分析计算CD4+T细胞群内CD4+IL-17A+细胞所占的比例。　　 五、实时荧光定量PCR(Realtime PCR)　　 取100mg肺组织，加入1ml Trizol试剂，冰浴匀浆，12000rpm离心10min，将上清转移至新管中，室温静置5 min;每管加入200μl氯仿，用力震荡30秒，室温静置3min;4℃，12000rpm，离心15 min;吸取上清至新的1.5ml EP管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇0.5ml，混匀后室温沉淀10 min;4℃，12000rpm离心10 min后，弃上清;加入4℃预冷的75％乙醇1ml，洗涤沉淀及离心管壁;4℃，7500rpm离心5 min，弃上清;室温干燥15分钟;加入30μl RNase-free水，至完全溶解，测定RNA浓度。应用Takara公司逆转录酶，将2μg RNA逆转录成cDNA，用ABI7500 Realtime PCR仪定量测定，相对定量法计算各组小鼠目标基因IFN-γ、IL-4、 IL-6、 IL-23、 IL-1βmRNA的表达水平。　　 六、统计学分析　　 全部数据采用SPSS16.0统计学软件进行分析，统计结果表示为mean±S.E.M，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异;当差异有统计学意义时，用SNK法进行组间比较，p＜0.05具有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、IL-17A的中和抑制SiO2所诱导的Th17型免疫应答　　 染尘后7天，SiO2抗体组脾中CD4+IL-17A+T细胞显著少于SiO2模型组。染尘后7天，SiO2模型组肺门淋巴结中CD4+IL-17A+T细胞显著高于对照组;染尘后7天，SiO2抗体组肺门淋巴结中CD4+IL-17A+T细胞显著低于SiO2模型组。IL-17A的中和可降低SiO2颗粒引起的免疫应答过程中Th17细胞的比例。　　 Realtime-PCR结果显示，染尘后7天，SiO2抗体组IL-6和IL-1β的表达均低于SiO2模型组。染尘后各时间点SiO2抗体组和SiO2模型组IL-23的表达无显著性差异。表明IL-17A的中和可抑制Th17细胞的分化。　　 二、IL-17A的中和导致SiO2所致的自身免疫应答减弱　　 ELISA检测血清中ANA和抗-dsDNA抗体的浓度。染尘后56天，SiO2模型组血清中ANA和抗-dsDNA抗体的浓度均高于对照组;SiO2抗体组血清中ANA浓度低于SiO2模型组，差别具有统计学意义;SiO2抗体组血清中抗-dsDNA抗体的浓度略低于SiO2模型组。结果表明IL-17A的中和可减轻SiO2所致自身免疫。　　 三、IL-17A的中和延迟SiO2所致的小鼠肺部炎性细胞的聚集　　 分类计数结果显示，染尘后7天，SiO2抗体组BALF中细胞总数显著低于SiO2模型组。染尘后7天，SiO2抗体组BALF中中性粒细胞和淋巴细胞均显著少于SiO2模型组。IL-17A的中和可抑制BALF中炎性细胞的聚集。　　 四、IL-17A的中和延缓SiO2诱导的Th1/Th2极化免疫应答进程　　 Realtime-PCR检测肺组织Th1型(IFN-γ)和Th2型(IL-4)细胞因子mRNA的表达水平。染尘后7天SiO2模型组小鼠肺组织中IFN-γ的表达明显升高;28天，56天SiO2模型组IFN-γ的表达有所下降。染尘后7天SiO2抗体组IFN-γ的表达较SiO2模型组低，28天SiO2抗体组IFN-γ的表达显著高于SiO2模型组和对照组，56天，SiO2抗体组IFN-γ的表达高于SiO2模型组。SiO2模型组IL-4的表达随时间逐渐增多。在染尘后56天SiO2模型组IL-4的表达达到最高峰，此时SiO2抗体组IL-4表达低于SiO2模型组。表明IL-17A的中和可延缓SiO2诱导的Th1和Th2型免疫应答。　　 结论：　　 1.IL-17A/Th17可促进SiO2所诱发的自身免疫反应　　 2.IL-17A的中和延缓实验性矽肺Th1/Th2极化免疫应答，为IL-17A/Th17促进SiO2诱发自身免疫的可能机制。