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目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是我国以及亚洲最常见的恶性肿瘤之一,其发生率与死亡率均居前列。肝癌侵袭、转移的分子机制研究,对肝癌的临床早期诊断、治疗、降低术后复发及转移以改善肝癌患者预后具有重要的现实意义。研究表明,血管生成的程度与肿瘤的分期密切相关,抑制肿瘤血管生成在一定程度上可抑制肿瘤的进展。跨膜丝氨酸蛋白酶4(transmembrane serine protease 4,TMPRSS4)是 Ⅱ 型跨膜丝氨酸蛋白酶(type II transmembrane serine protease,TTSPs)家族中的重要一员,具有较为典型的丝氨酸蛋白酶的结构特征,研究已证实其可促进肝细胞癌的复发及转移。前期研究表明,TMPRSS4可通过诱导肝癌上皮-间充质转化促进肝癌侵袭、转移,但其对肝癌血管生成的影响及相关机制目前尚不清楚。本研究拟在前期研究的基础上,进一步探索TMPRSS4诱导肝细胞癌的血管生成的作用及其机制,为防治肝细胞癌提供新的治疗靶点与理论支持。方法:(1)采用人肝癌细胞株MHCC97H与HuH-7细胞系进行实验:本实验采用肝癌细胞株MHCC97H与HuH-7细胞系。首先转染TMPRSS4过表达的慢病毒,以构建TMPRSS4上调的肝癌细胞株。根据实验需要,我们将细胞分为:肝癌细胞的对照(control)组、空白载体转染(Lv-GFP)组和 TMPRSS4 过表达(Lv-TMPRSS4)组。稳转细胞株建立后,将两种细胞株的control组、Lv-TMPRSS4肝癌细胞接种于裸鼠皮下成瘤。(2)观察指标及方法:体外培养上述肝癌细胞株,Matrigel胶成管实验检测不同TMPRSS4表达肝癌细胞株培养48h的细胞上清液对人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926细胞)成管能力的影响;对皮下种瘤的肿瘤组织进行CD34染色以判断体内条件下TMPRSS4作用于血管生成的能力;PCR检测不同TMPRSS4表达的肝癌细胞株的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达量,Western Blot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)以及磷酸化mTOR的表达量。结果:(1)TMPRSS4过表达细胞的构建TMPRSS4过表达慢病毒载体、空白载体转染人肝癌细胞株MHCC97H、HuH-7细胞株48h后,在荧光显微镜下可见转染空白载体的(Lv-GFP)及TMPRSS4过表达慢病毒载体(Lv-TMPRSS4)的肝癌细胞均带有绿色荧光,未转染慢病毒载体的对照组细胞在荧光显微镜下未见绿色荧光。qRT-PCR、Western Blot结果显示慢病毒载体转染48h后,转染TMPRSS4过表达载体的肝癌细胞TMPRSS4的表达水平显著增高。说明人肝癌TMPRSS4过表达细胞株构建成功。(2)TMPRSS4促进内皮细胞血管拟态形成Matrigel胶成管实验显示,加入TMPRSS4过表达肝癌细胞细胞上清培养液后,人脐静脉细胞在基质胶中的成管能力显著高于对照组及空白载体组。这表明TMPRSS4分泌了促肿瘤血管生成因子,从而促进了脐静脉内皮细胞在基质胶中的血管拟态形成。(3)体内实验证实TMPRSS4可诱导肝癌血管生成免疫组化结果显示,TMPRSS4过表达的HuH-7细胞所形成的肿瘤组织中TMPRSS4表达显著增强。CD34结果显示TMPRSS4过表达组肿瘤组织的微血管密度(microvesseldenisity,MVD)显著高于对照组。这说明在体内条件下,TMPRSS4可促进肝细胞癌微血管形成。(4)TMPRSS4可促进肝癌细胞分泌VEGFqRT-PCR结果显示:Lv-TMPRSS4过表达组的VEGF表达量显著高于对照组及转染空白载体组。(5)TMPRSS4可促进肝癌细胞内的p-mTOR表达Western Blot结果显示,Lv-TMPRSS4过表达组的p-mTOR表达量显著高于对照组及转染空白载体组,总mTOR表达量无显著改变。结论:(1)跨膜丝氨酸蛋白酶4可在体内、体外条件下促进肝细胞癌的血管生成。(2)TMPRSS4可显著上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达。(3)TMPRSS4可以激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),使磷酸化的(p-mTOR)表达量显著上调。