一、目的随着免疫学和分子生物学的进步，人们发现肿瘤也是一种免疫性疾病，与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，而这种缺陷同机体内成熟树突状细胞的功能下调有关。故通过体外培养DC细胞来诱导激发患者的肿瘤免疫成为一种可行的思路。其中关键是提供给DC可递呈的肿瘤抗原并高效地激活良好活性的CTL。目前最有效的方法是通过病毒载体转染肿瘤抗原肽基因给DC从而使后者获得持续大量的抗原肽刺激T细胞。而在几种病毒载体中，重组腺相关病毒(rAAV)是最合适的候选者。而对于前列腺癌，由于其特异的PSA抗原，为使用DC进行诱导特异性的CTL针对肿瘤治疗提供了非常合适的靶向性，也成为理想的DC免疫治疗热点。我科与国外合作单位合作制造出携带PSA的rAAV，本文将验证其转染体外培养的DC细胞后激活的CTL对前列腺癌细胞株LNCaP的杀伤作用及其对于裸鼠前列腺癌移植瘤的预防和治疗作用。二、研究内容第一部分DC疫苗对肿瘤细胞株的体外杀伤作用1研究方法1．1 rAAV／PSA转染DC并诱导CTL取HLA-A2+的健康志愿者外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(DC前体细胞)，培养于6孔板，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞(T细胞，AIM-V另瓶培养)。取贴壁细胞，以两种方式刺激DC前体细胞，包括rAAV／PSA(第0天刺激)和LNCaP细胞冻融裂解物(第五天刺激)，前者感染后5h更换为新鲜AIM-V培养基，各组细胞均采用GM-CSF、IL-4诱导DC前体细胞成熟。第七天，取原先另瓶培养的T细胞与培养所得DC按DC：T为1：20比例混合，以AIM-V为培养基，同时加入GM-CSF、IL-2及IL-7，共育5—7天，诱导获得CTL。1．2 DC和CTL表面标志检测及释放因子检测DC培养第7天，收集悬浮细胞(成熟DC)，流式细胞仪分析DC表面标志，在培养第14天，通过流式细胞仪分析CTL群体中CD8／CD4和CD8／CD56的比值情况。同时检测DC分泌IL-12及CTL分泌IFN-γ情况。1-3 CTL杀伤LNCaP细胞作用取对数生长期的LNCaP细胞作靶细胞，台盼兰染色测定细胞活力，调细胞浓度1×10~5／ml，加入96孔板中，100μl／孔，作为靶细胞；用F12液调整上述不同方式诱导成熟的效应T细胞浓度为5×10~6／ml，按照效靶比为5：1、10：1、20：1、40：1的比例设置实验组混合CTL细胞与肿瘤细胞，每比例3复孔，余3孔不与效应细胞混合；效应细胞按以上效靶比的数量加入96孔板，每种浓度3复孔。继续培养12小时，加入每孔加入浓度为5mg／ml的MTT10μl，继续培养6h，加入100μl盐酸化异丙醇／孔。静置5min后在酶标仪上选取570nm波长测定每孔吸光度值(A值)，杀伤率％=[1-(实验组A-效应细胞A均值)／靶细胞A均值]×100％。另外对比进行针对DU145杀伤试验。2研究结果rAAV／PSA成功转染了DC前体细胞(单核细胞)，DC培养良好，rAAV／PSA转染的DC表面标志CD80、CD86、PSA明显高表达，分泌IL-12高于其他组。仅用一周诱导的CTL中CD8／CD4和CD8／CD56的比值均明显增高，IFN-γ表达明显增高，而且对PSA阳性的LNCaP细胞有很好的细胞毒杀伤效应。3研究结论以rAAV为载体介导抗原基因转染DC，并诱导特异的CTL，从技术上是可行，获得的CTL有较高抗肿瘤活性。第二部分裸鼠体内肿瘤抑制实验1研究方法1．1裸鼠成瘤试验选取雄性裸鼠12只，4-6周龄，随机分成4组，各3只，其中一组给予1×10~6LNCaP细胞于裸鼠皮下注射；一组给予5×10~6LNCaP细胞于裸鼠皮下注射；第三组给予1×10~6LNCaP细胞与Matrigel混合后注射于裸鼠皮下；最后一组给予5×10~6LNCaP细胞与Matrigel混合后注射于裸鼠皮下。观察6周后，前三组均未见成瘤，最后一组全部出现瘤体。第一组再给予5×10~6LNCaP细胞于裸鼠皮下注射，6周后仍未成瘤。1．2 CTL裸鼠体内分组试验将20只雄性裸鼠随机分成四组，第一组为对照组，1天前于注射部位同侧给予AIM-V培养基皮下注射，试验时给予5×10~6LNCaP细胞与Matrigel混合后注射于裸鼠右腰侧皮下，成瘤后同治疗组，同时在瘤体内注射AIM-V培养基0.20ml；第二组为预防组，于1天前于注射部位同侧给予1×10~8个，即20：1比例注射rAAV／PSA转染DC激活的CTL细胞，再于相同部位给予5×10~6LNCaP细胞与Matrigel混合后注射于裸鼠皮下；第三组为延迟预防组，于7天前于注射部位同侧给予1×10~8个CTL细胞；第四组为治疗组，按照第一组操作，至成瘤后给予瘤内rAAV／PSA转染DC激活的CTL细胞注射一次，第8周后全部处死，观察它们的成瘤时间、成瘤大小和八周后瘤重。每2周于裸鼠尾部抽取100μl血液进行PSA血清学检查。2研究结果虽然利用不同数量、不同年龄，如单独使用LNCaP细胞皮下注射，均未成瘤，与部分文献报道相反，与部分文献报道相符。而利用Matrige混合成瘤，采取低细胞量，也未达到皮下成瘤，只有在高细胞量时获得100％的成瘤率。而瘤细胞成瘤前提前1天使用CTL细胞能取得预防作用，的确延误了肿瘤的成长，但最后也获得了相应的肿瘤；提前7天注射则无明显预防作用；而成瘤后杀瘤，部分抑制了瘤体的长大，起到了杀瘤的作用。3研究结论裸鼠前列腺癌细胞株LNCaP成瘤是非常困难的，尤其是单独成瘤，必须混合Matrigel才能辅助成瘤，而且浓度不能太低。以rAAV为载体介导抗原基因转染DC，并诱导特异的CTL，模仿DC疫苗注射，给予CTL可以预防肿瘤的发生，但最终未能完全抑制。而对于瘤体的注射也能防止瘤体的增大，起到了杀瘤的作用。三、结论rAAV／PSA转染DCs，未明显改变DCs表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能，可诱导自体CTL增殖，CTL对LNCaP细胞有明显杀伤作用。这种病毒转染方式递呈特异性抗原明显优于直接细胞裂解蛋白提取物递呈抗原给DCs。使用腺相关病毒制备的DC疫苗对于裸鼠前列腺癌移植瘤具有一定的预防和治疗作用。DC疫苗有望成为前列腺癌患者免疫治疗的有效补充手段。