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目的肝脏调节体内糖、脂肪、蛋白质的代谢,对于2型糖尿病的发生和进展至关重要。糖尿病肝脏损伤主要表现为肝内脂肪浸润导致非酒精性脂肪性肝病,由于发病机制目前尚未完全阐明,因此并无特异性治疗药物或手段。肝脏是重要的天然免疫器官,也是炎症介导的主要靶器官,免疫和炎症在非酒精性脂肪性肝病的发生、发展过程中作用不容忽视。传统中药—雷公藤具有强大的抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抑制免疫等药理活性,雷公藤红素是雷公藤的主要活性单体,其药理活性显著而广泛。目前为止,国内外均未见关于雷公藤制剂对糖尿病肝脏损伤的作用研究。本课题从动物整体水平和细胞水平,评价雷公藤对糖尿病脂肪性肝脏损伤的作用,并应用rna干扰技术特异性沉默致病基因,旨在进一步探讨雷公藤可能的作用机制。方法1.体内研究:sprague-dawley大鼠75只,雄性清洁级,随机选取15只作为正常对照组(nc组,n=15)予标准饲料喂养,其余60只大鼠予高脂高糖饲料喂养。喂养8周后尾静脉注射链脲佐菌素30mg/kg诱导2型糖尿病大鼠模型。成模大鼠随机分为4组:糖尿病模型组(dm组)、雷公藤多苷低剂量干预组(dm+tl组,1mg/kg·d)、雷公藤多苷中剂量干预组(dm+tm组,3mg/kg·d)和雷公藤多苷高剂量干预组(dm+th组,6mg/kg·d)。干预8周后处死取材,检测血糖、肝肾功能、血脂、血常规等生化指标,测量大鼠体重(bw)、肝重(lw),计算肝指数;hematoxylin-eosin及masson染色光学显微镜下观察各组大鼠肝组织病理形态的改变;elisa法检测各组大鼠血清炎症因子nf-κb,il-1β和tnfα水平;应用免疫组织化学技术、rt-pcr和westernblotting技术观察各组大鼠肝组织tlr4,myd88,nf-κb,p-iκbα及下游炎症因子il-1β和tnfα基因和蛋白的表达。2.体外研究:游离脂肪酸(ffas,棕榈酸:油酸=1:2)诱导人源肝癌细胞株(hepg2细胞)脂肪变性,油红o染色观察细胞脂质沉积情况;应用cck8法检测细胞生存率。体外化学合成tlr4sirna,应用rna干扰技术转染hepg2细胞株,并筛选有效基因沉默序列。实验分为7组:正常对照组、ffas组、ffas+阴性空转组、ffas+tlr4sirna组、ffas+雷公藤红素组、ffas+雷公藤红素+阴性空转组、ffas+雷公藤红素+tlr4sirna组。rt-pcr和westernblotting技术从蛋白水平和基因水平检测各组hepg2细胞tlr4,myd88,nf-κb及下游炎症因子il-1β和tnfα表达。结果1.体内研究:(1)造模结果:高脂高糖喂养8周后大鼠血脂、胰岛素水平和胰岛素抵抗指数homa-ir、胰岛素分泌指数homa-β均较常规喂养组明显升高(p<0.05),说明出现胰岛素抵抗和高胰岛素血症;尾静脉注射小剂量链脲佐菌素后,高脂组大鼠血糖明显升高,出现典型“三多一少”症状,提示2型糖尿病大鼠模型制备成功。(2)一般指标:(1)生化指标:与nc组相比,dm组和雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠血糖、总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)均明显升高(p<0.05);与dm组相比,雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠血糖、tc和tg无明显改变(p>0.05)。各组大鼠间肝、肾功能和血常规均无统计学差异(p>0.05)。(2)体重、肝指数(lw/bw):与nc组相比,dm组和雷公藤多苷不同剂量干预组大鼠体重明显降低(p<0.05);dm组和雷公藤多苷不同剂量干预组间大鼠体重无明显差异(p>0.05)。与nc组相比,dm组大鼠lw/bw明显升高(p<0.05),dm+th组lw/bw低于dm组(p<0.05),但仍高于nc组(p<0.05)。(3)雷公藤多苷对糖尿病大鼠肝组织病理形态学的影响:光镜下h&e染色显示,nc组大鼠肝小叶结构完整、清晰,肝细胞大小形态正常,无炎性细胞浸润;dm组肝小叶结构轮廓大致消失,肝细胞排列紊乱,肿胀呈弥漫性大泡样脂肪变性,汇管区可见炎性细胞浸润;雷公藤多苷干预组有不同程度减轻,dm+th组改善最明显。masson染色显示,nc组大鼠无明显纤维组织增生,dm大鼠可见门脉区少量纤维组织增生,雷公藤多苷各干预组有不同程度减轻。(4)雷公藤多苷对糖尿病大鼠血清中炎性介质水平的影响:与nc组相比,dm组大鼠血清nf-κb、il-1β和tnf-α含量显著升高(p<0.05);与dm组相比,雷公藤多苷各干预组大鼠血清各因子水平有不同程度降低(p<0.05),呈剂量依赖性。(5)雷公藤多苷对糖尿病大鼠肝组织tlr4/myd88/nf-κb免疫炎症信号通路的影响:与nc组相比,dm组大鼠肝组织tlr4,myd88,nf-κb,p-iκbα和下游炎症因子IL-1β,TNF-αmRNA和蛋白表达均明显增加(P<0.05);与DM组相比,雷公藤多苷各干预组各因子mRNA和蛋白表达呈现剂量依赖性降低(P<0.05)。2.体外研究:(1)最佳FFAs浓度筛选:HepG2细胞给予0.5mM FFAs呈现明显脂肪变性,且与正常对照组相比,不影响细胞活力(P>0.05)。因此,确定0.5mM FFAs为最佳诱导浓度。(2)最佳雷公藤红素浓度筛选:脂肪变性的HepG2细胞给予0.5μM雷公藤红素可见红色脂滴显著减少,与对照组相比,不影响细胞活力(P>0.05)。因此,确定0.5μM雷公藤红素为最佳干预浓度。(3)荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率:脂质体转染TLR4 siRNA 24小时后,荧光显微镜下细胞分布处胞浆均可见绿色荧光,流式细胞术检测转染效率均达到90%以上。说明成功转染干扰基因进入HepG2细胞,并且达到较高的转染效率。(4)有效沉默序列的筛选:TLR4 siRNA序列3转染HepG2细胞48小时,TLR4基因和蛋白表达量最少,因此筛选TLR4 siRNA序列3为最有效沉默序列。(5)雷公藤红素对脂肪变性HepG2细胞TLR4/MyD88/NF-κB免疫炎症信号通路的影响:与NC组相比,FFAs组HepG2细胞TLR4,MyD88,NF-kB和下游炎症因子IL-1β,TNF-αmRNA和蛋白表达量都显著增加(P<0.05);与FFAs组相比,TLR4 siRNA组和雷公藤红素干预组各因子表达都显著降低(P<0.05),TLR4 siRNA和雷公藤红素联合干预组表达进一步降低(P<0.05),NF-κB及下游炎症因子抑制率低于TLR4。结论雷公藤多苷能够减轻糖尿病大鼠肝脏损伤,其机制可能与下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,从而减少下游细胞因子的释放有关。雷公藤红素可部分阻断TLR4介导的免疫炎症信号通路,与TLR4 siRNA联用具有协同作用;除阻断TLR4信号通路外,雷公藤红素亦有可能通过其它通路调控下游炎症介质的表达,发挥肝脏保护作用。