论文部分内容阅读
慢性粒细胞白血病的特征性融合蛋白BCR-ABL通过其SH3结构域与RIN1蛋白高特异性低亲合力结合,导致酪氨酸激酶活性持续活化,促进疾病发生发展。课题组前期通过计算机药物设计技术获得ABLSH3突变体SH3-T79Y,通过其与RIN1蛋白相互作用并联合伊马替尼(Imatinib, IM),可在体外有效抑制慢粒细胞株K562及KCL22细胞增殖、促进凋亡。本课题拟检测SH3-T79Y联合IM作用于慢粒耐药细胞株K562/G01引起的增殖、凋亡效应改变,并分析其发生作用的机制；构建小鼠皮下瘤和血液瘤模型,进一步探讨SH3-T79Y联合IM对KCL22细胞在动物体内的增殖能力和致病性的影响。采用的实验方法如下：1 Western Blot检测不同浓度的IM对K562/G01细胞p-BCR-ABL蛋白的影响,筛选联合用药的IM浓度；SH3-T79Y与IM联合处理细胞后,采用克隆形成实验和流式细胞术检测细胞周期分析细胞增殖,瑞氏染色观察细胞形态学变化、流式细胞术检测细胞凋亡率分析细胞凋亡效应。2 SH3-T79Y联合IM用药处理K562/G01细胞后,Western Blot检测p-BCR-ABL/BCR-ABL、p-CrkL/CrkL、p-Stat5/Stat5、p-Akt/Akt、MEK、p-Erk/Erk、Bcl-2、Bax、c-Myc、Cyclin-D1、Caspase-8、BID和Caspase-3蛋白表达水平的变化,分析联合用药作用机制。3 SH3-T79Y联合IM处理KCL22细胞后,经皮下注射于Balb/c裸鼠构建皮下实体瘤模型,经尾静脉注射于NOD-SCID小鼠构建慢性粒细胞白血病移植瘤模型,以IM单独处理和经PBS处理的KCL22细胞为对照组。通过比较小鼠一般情况,计算皮下瘤成瘤率,瑞氏染色监测血液瘤模型鼠骨髓和外周血象变化,HE染色观察肝、脾组织肿瘤细胞浸润情况,PCR检测其骨髓细胞bcr-abl基因表达水平,绘制生存曲线,探讨联合用药对KCL22细胞在实验动物体内增殖能力和致病性的影响。通过以上实验,获得如下结果和结论：1 K562/G01细胞对IM耐药,联合用药IM浓度选择为3 μM。SH3-T79Y联合IM作用使K562/G01细胞克隆形成率明显降低,细胞周期阻滞在S期；瑞氏染色见凋亡小体、核聚集、核碎裂等典型凋亡现象,细胞凋亡率显著增加。结果证实：SH3-T79Y联合IM可在体外有效抑制K562/G0 1细胞增殖、促进凋亡。2 SH3-T79Y联合IM可明显抑制K562/G01细胞BCR-ABL、CrkL磷酸化水平；抑制下游信号通路p-Stat5/Stat5、p-Akt、MEK、p-Erk/Erk蛋白表达；抑制凋亡相关蛋白Bcl-2、c-Myc,增加Bax；抑制周期蛋白Cyclin-D1;同时可促进Caspase-8、Caspase-3活化,对BID没有明显影响。结果证实：SH3-T79Y联合IM用药影响K562/G01细胞增殖和凋亡的机制与调节BCR-ABL底物水平、影响下游信号通路相关蛋白及凋亡相关蛋白等有关。3 Balb/c裸鼠皮下瘤模型中PBS对照组、IM单独处理组、联合用药组成瘤率分别为100%、33.3%、16.7%。NOD-SCID小鼠CML移植瘤模型中,PBS对照组于注射细胞后约4周开始逐渐出现反应力下降、精神萎靡、股骨肌肿大、后肢骨节出血点等体征,外周血白细胞从第5周逐渐增多,计数显著升高,血涂片可见幼稚粒细胞,肝、脾组织切片及骨髓涂片可见白血病细胞浸润,骨髓细胞高表达bcr-abl融合基因,未经治疗存活约70天。SH3-T79Y联合IM处理组小鼠一般状况良好,外周血血象正常,肝脾组织病理检查未见异常变化,骨髓几乎未表达bcr-abl基因,生存时间大于90天。IM单独处理组各项观察指标结果位于PBS对照组和联合用药处理组之间。结果证实：SH3-T79Y与IM联合用药可以显著抑制KCL22细胞在小鼠体内的增殖能力,且效果明显优于单独使用IM。