论文部分内容阅读
MicroRNA(miRNA)在卵泡发育的每个阶段中都有差异表达。许多miRNA介导生殖内分泌功能,特别是卵母细胞成熟和卵泡形成过程,并通过其靶基因调节卵泡闭锁,从而调节卵母细胞凋亡。影响绵羊绵羊卵泡颗粒细胞(Follicle Granulosa Cells,FGC)的凋亡的因素众多,迄今为止,还不确定let-7家族是否通过MAP3K1介导FGC的凋亡。本研究旨在研究let-7b对FGC凋亡和发育作用及机理。收集原代绵羊FGC,分别用不同浓度胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(0%、7%、10%、12%、15%、18%、20%),M199基础培养基和DMEM培养基体外培养绵羊FGC,用CCK-8试剂盒检测其对绵羊FGS增殖的影响,探究体外培养绵羊FGC的最适FBS浓度和最适基础培养基;再用CCK-8试剂盒检测探究不同浓度促卵泡激素(Follicle-Stimulating Hormone,FSH)(0、5、10、20、30、40 IU/mL)以及不同浓度褪黑素(Melatonin,MT)(0、5、10、20、30、40 ng/mL)对绵羊FGC体外增殖影响。用let-7b模拟物let-7b抑制剂分别以不同的剂量(40、60、80、100和120μM)转染绵羊FGC。使用CCK-8试剂盒检测其对绵羊FGS生长及增殖的影响。使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MAP3K1 mRNA表达水平,Western Blot法分析MAP3K1蛋白表达水平。293T细胞与MAP3K1-mimic-WT和MAP3K1-mimic-MU共转染,双荧光素酶法验证let-7b对MAP3K1靶向作用。M199培养基和DMEM培养基两组当FBS浓度为12%时,FGC增值率最高(P<0.01),FGC生长情况最好。随着FSH浓度越高,绵羊FGS生长增殖率增大,促进FGC生长,当FSH浓度超过20 IU/mL,反而对绵羊FGC体外培养会有抑制作用;随着MT浓度越高,绵羊FGC生长增殖率增大,促进生长,当MT浓度超过20 ng/mL,对绵羊FGC体外培养会有抑制作用。与CG相比,MIM-2,MIM-3和MIM-4组的FGC增殖活性降低。MIM-4组的增殖活性明显低于CG和MIM-1组(P<0.05)。let-7b模拟物明显降低FGC的let-7b表达水平。发现的最大减少量是MIM-4。MIM-3和MIM-4组的MAP3K1 mRNA和蛋白水平低于CG。MIM-3和MIM-4组的MAP3K1 mRNA和蛋白水平低于CG(P<0.05或P<0.01)。INH-3和INH-4组的MAP3K1 mRNA和蛋白表达水平高于CG和INH-1组。与GC相比,let-7b模拟物的共转染显着抑制了荧光素酶活性(P<0.05)。研究结果表明,FBS浓度为12%时最适宜FGC的生长发育;M199培养基相较DMEM培养基更适用于FGC体外培养。当FSH浓度为20 IU/mL,MT浓度为20 ng/mL时对体外培养的绵羊FGS生长情况最好,FSH浓度超过20 IU/mL,或者MT浓度大于20 ng/mL时,对绵羊FGC体外培养会有抑制作用;let-7b可以明显抑制绵羊FGC的细胞活力,并促进其凋亡。较高剂量的let-7b模拟物和抑制剂(80μM和100μM)可以分别显着抑制和促进绵羊FGC中let-7b mRNA,MAP3K1 mRNA和蛋白的表达。let-7b通过抑制MAP3K1基因促进FGC凋亡。