脑缺血性疾病严重危害当代人类健康,具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点,给患者及家庭带来沉重的负担。因而研究脑缺血性疾病的发病机制,设法提高神经元对缺血性损害的抵抗力,是亟待研究解决的重要课题。研究表明,谷氨酸的兴奋性毒性是脑缺血时神经元损伤的重要机制。脑内谷氨酸的稳态主要依靠胶质细胞谷氨酸转运体-1（glial glutamate transporter-1,GLT-1）,通过调控GLT-1,增强其对细胞外液中谷氨酸的摄取,是防止脑缺血时谷氨酸神经毒性作用的有效方法。预先给予动物轻微、短时、不至于引起神经元损伤的脑缺血,可以保护神经元,使其能够耐受其后的通常会引起神经元损伤的较严重的脑缺血,这一现象被称为脑缺血耐受（brain ischemic tolerance,BIT）,预先给予的轻微、短时的脑缺血称为脑缺血预处理（cerebral ischemic preconditioning,CIPC）。本课题组前期研究发现,脑缺血预处理可上调星形胶质细胞GLT-1表达诱导脑缺血耐受。但是,脑缺血预处理如何上调GLT-1诱导脑缺血耐受,尚有更加深入的机制亟待阐明。非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）包括长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和微小RNA（micro RNA,miRNA）,是一类不具有蛋白质编码功能的RNA,在各种疾病中发挥着重要的调控作用。在细胞质中,lncRNA可作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）与mRNA竞争性结合miRNA,从而抑制miRNA对mRNA调控,参与靶基因mRNA的表达调控,从而在疾病的发生发展中发挥重要作用。有研究表明,缺血性脑卒中时,lncRNA-miRNA-mRNA通过ceRNA机制参与调节缺血再灌注引发的氧化应激、炎症反应、凋亡、自噬等多种病理生理过程。且已有文献报道,在神经退行性疾病中,多种非编码RNA对GLT-1有调控作用,因而本文旨在探究lncRNA-miRNA是否通过ceRNA机制调控GLT-1从而参与脑缺血耐受诱导。第一部分lncRNA BIRF上调GLT-1参与脑缺血预处理诱导脑缺血耐受的机制研究目的:1.通过高通量测序及生物信息学分析,构建ceRNA调控网络,探寻参与脑缺血耐受诱导的lncRNA。2.验证lncRNA BIRF与脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受及GLT-1表达的关系。方法:1.高通量测序及验证取出生24 h内新生鼠大脑皮层,进行神经元和星形胶质细胞分层共培养,随机分为2组（n=2）:（1）对照组:星形胶质细胞与神经元共培养2 d后,不进行氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;（2）缺血预处理（ischemic preconditioning,IPC）组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行45 min的OGD处理,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中。于IPC后6 h时间点收集星形胶质细胞,送往中科普瑞公司进行lncRNA高通量测序。选取测序结果中5个上调和5个下调的lncRNA,通过qRT-PCR技术,在3批独立培养的星形胶质细胞中,验证测序结果的可信性。2.ceRNA网络预测分析委托上海中科普瑞公司,进行以GLT-1为中心的ceRNA互作网络分析。3.IPC对lncRNA 1-7表达的影响根据测序结果中lncRNAs表达量及表达变化倍数,筛选出7条目的lncRNA进行验证。分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为2组（n=3）:（1）对照组;（2）IPC组。6 h时间点收集细胞,qRT-PCR检测lncRNA 1-7表达。4.下调lncRNA1-7表达对OGD耐受的影响将7条lncRNA siRNA分别转染共培养的星形胶质细胞,48 h后用qRT-PCR检测敲低效率,筛选得到效率高的siRNA共5条,用于下述实验。分组如下（n=3）:（1）IPC+OGD组:45 min OGD作为IPC,间隔24 h后,进行4 h OGD作为损伤性OGD;（2）IPC+OGD+lncRNA 1-5siRNA组:IPC前,在培养基中分别加入lncRNA 1-5 siRNA,其余步骤同IPC+OGD组;（3）IPC+OGD+lncRNA siRNA NC组:IPC前于培养基中加lncRNA siRNA NC,其余步骤同IPC+OGD组。各组于末次恢复氧葡萄糖供应1 d时,应用CCK8法评价神经元活性,研究lncRNA 1-5 siRNA能否抑制IPC所诱导的OGD耐受。5.下调lncRNA 1-5表达对GLT-1蛋白表达的影响分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,分组如下（n=3）:（1）IPC组;（2）IPC+lncRNA 1-5 siRNA组:IPC前,在培养基中分别加lncRNA1-5 siRNA,其余步骤同IPC组;（3）IPC+lncRNA siRNA NC组:IPC前,在培养基中加lncRNA siRNA NC,其余步骤同IPC组。各组于末次恢复氧葡萄糖供应后6 h时,收集星形胶质细胞,通过western blot研究对GLT-1蛋白表达的影响。6.LncRNA亚细胞定位采用共培养的星形胶质细胞（n=3）,通过RNA荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）检测lncRNA的亚细胞定位。7.脑缺血预处理对lncRNA BIRF表达的影响采用大鼠四血管闭塞法全脑缺血模型,分组如下（n=5）:（1）Sham组:进行全脑缺血假手术;（2）CIPC组:3 min全脑缺血后恢复血供。于末次缺血后2 d时取大鼠海马CA1区,qRT-PCR检测lncRNA BIRF的表达。8.下调lncRNA BIRF表达对脑缺血耐受的影响采用大鼠四血管闭塞法全脑缺血模型,分组如下（n=5）:（1）Sham组;（2）IS组:8 min全脑缺血后恢复血供;（3）CIPC+IS组:3 min全脑缺血作为CIPC,间隔2 d后,进行8 min全脑缺血作为损伤性缺血;（4）CIPC+IS+sh-BIRF组:在CIPC之前侧脑室注射sh-BIRF腺相关病毒,其余步骤同CIPC+IS组;（5）CIPC+IS+sh-NC组:CIPC前侧脑室注射sh-NC腺相关病毒阴性对照,其余步骤同CIPC+IS组。末次缺血后7 d取材,通过硫堇染色观察神经元的存活情况。9.下调lncRNA BIRF表达对GLT-1蛋白表达的影响采用大鼠四血管闭塞法全脑缺血模型,分组如下（n=5）:（1）Sham组;（2）CIPC组;（3）CIPC+sh-BIRF组:在CIPC之前侧脑室注射sh-BIRF腺相关病毒,其余步骤同CIPC组;（4）CIPC+sh-NC组:CIPC前侧脑室注射sh-NC腺相关病毒阴性对照,其余步骤同CIPC组。于末次缺血后2 d时,取大鼠海马CA1区,通过western blot观察GLT-1的表达。结果:1.IPC组星形胶质细胞lncRNA表达谱呈显著差异高通量测序结果显示,与对照组相比,IPC组lncRNA有323个显著下调,329个显著上调。通过对3次独立培养的星形胶质细胞进行qRT-PCR验证,证实lncRNA测序结果可信。2.构建出以GLT-1为核心的ceRNA互作网络根据lncRNA,miRNA的测序结果,45个lncRNA,60个miRNA参与了以GLT-1为核心的ceRNA互作网络,这些ncRNA可能通过ceRNA机制参与GLT-1的调控。3.IPC组目的lncRNAs的表达变化根据lncRNA表达谱中lncRNA的表达量和差异变化倍数,选择其中的7条作为目的lncRNA进行后续实验,发现IPC处理后,6条升高、1条降低。qRT-PCR结果显示,与Control组相比,NONRATT010451.2、NONRATT021426.2、NONRATT029757.2、NONRATT001933.2、NONRATT010720.2和NONRATT009133.2在IPC组的表达量明显升高（FC值大于2倍以上）（P＜0.05）,只有NONRATT026094.2表达下调（P＜0.05）。4.验证目标lncRNA对神经元存活的影响CCK8结果显示,向共培养的星形胶质细胞分别转染NONRATT010720.2、NONRATT021426.2、NONRATT010451.2、NONRATT009133.2、NONRATT001933.2这5条lncRNA的siRNA,之后共培养细胞进行IPC+OGD处理,与IPC+OGD+siRNA NC组相比,转染siRNA后神经元活性均明显降低（P＜0.05）。5.NONRATT009133.2对GLT-1蛋白表达影响最大Western blot结果显示,在转染上述5条lncRNA siRNA后,NONRATT021426.2、NONRATT009133.2、NONRATT001933.2均对GLT-1表达产生抑制作用（P＜0.05）,其中NONRATT009133.2抑制作用最显著,因此,选出NONRATT009133.2用于后续研究,根据其功能作用将其命名为“Brain Ischemia Related Factor”（lncRNA BIRF）。6.lncRNA BIRF在星形胶质细胞中的亚细胞定位FISH结果显示lncRNA BIRF在细胞质和细胞核中均大量表达,提示其在细胞质或细胞核中均可能发挥重要调控作用。7.脑缺血预处理引起lncRNA BIRF表达升高qRT-PCR结果显示,CIPC组lncRNA BIRF的表达量是Sham组的5.2128倍（P＜0.05）。8.下调lncRNA BIRF阻碍脑缺血耐受诱导硫堇染色结果显示,IS组大鼠海马CA1区神经元严重受损,CIPC+IS组海马神经元的损伤明显减轻,而提前经侧脑室注射sh-BIRF敲低lncRNA BIRF表达之后再进行CIPC+IS则会抑制缺血耐受,使神经元损伤再次加重。表明lncRNA BIRF可促进脑缺血耐受诱导。9.下调lncRNA BIRF可抑制脑缺血耐受过程中GLT-1的表达Western blot结果表明,CIPC前经侧脑室注射sh-BIRF敲低lncRNA BIRF表达会抑制CIPC引起的GLT-1升高。因此证明lncRNA BIRF可同向调控GLT-1的表达。小结:IPC处理后lncRNA的表达谱发生明显差异性变化,其中lncRNA BIRF表达升高,通过上调GLT-1表达促进脑缺血预处理诱导脑缺血耐受。第二部分miR-330-5p通过靶向调控GLT-1参与脑缺血预处理诱导脑缺血耐受的机制研究目的:在分子水平、细胞水平、在体水平证明miR-330-5p可通过直接靶向结合GLT-1参与脑缺血预处理诱导脑缺血耐受。方法:1.高通量测序及验证委托上海中科普瑞公司进行miRNA高通量测序,并且比较Control组和IPC组的表达差异。选取测序结果中5个上调和5个下调的miRNA,通过qRT-PCR技术,在3批独立培养的星形胶质细胞中验证测序结果的可信性。2.筛选可以与lncRNA BIRF和GLT-1形成ceRNA互作关系的miRNA根据miRNA的测序结果,结合ceRNA网络预测,选出IPC组表达下调、并且与lncRNA BIRF及GLT-1 mRNA都有结合位点的miRNA,共2条,分别是miR-22-3p和miR-330-5p,用于下述研究,对lncRNA、miRNA、GLT-1的结合位点进行分析预测。3.论证过表达miR-22-3p或miR-330-5p对GLT-1蛋白表达的影响分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为4组（n=3）:（1）IPC组;（2）IPC+miRNA mimics NC组:IPC之前预先转染miRNA mimics阴性对照,其余步骤同IPC组;（3）IPC+miR-22-3p mimics组:IPC之前预先转染miR-22-3p mimics,其余步骤同IPC组;（4）IPC+miR-330-5p mimics组:IPC之前预先转染miR-330-5p mimics,其余步骤同IPC组。各组于末次恢复氧葡萄糖供应后6 h时收集星形胶质细胞,通过western blot研究对GLT-1蛋白表达的影响,从中选出调控效果最明显的miRNA,用于后续的实验。4.双荧光素酶报告基因分析验证miR-330-5p是否特异性调控GLT-1验证miR-330-5p能否直接结合GLT-1的预测靶点。将GLT-1基因的靶点（野生型和突变型）序列构建到荧光素酶报告基因载体中,同时合成miR-330-5p的模拟物,共转染至HEK293-T细胞。分组如下（n=3）:（1）miRNA mimics NC+GLT-1-wt;（2）miR-330-5p mimics+GLT-1-wt;（3）miRNA mimics NC+GLT-1-mut;（4）miR-330-5p mimics+GLT-1-mut。于转染后24 h时间点使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶的荧光强度,从而确定GLT-1是所选miR-330-5p的靶基因。5.IPC对miR-330-5p表达的影响分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为2组（n=3）:（1）对照组;（2）IPC组。IPC后6 h时间点收集细胞,qRT-PCR检测miR-330-5p的表达。6.过表达miR-330-5p对OGD耐受的影响分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为5组（n=3）:（1）Control组;（2）OGD组;（3）IPC+OGD组;（4）IPC+OGD+miR-330-5p mimics组:IPC前于培养基中加miR-330-5p mimics,其余步骤同IPC+OGD组;（5）IPC+OGD+miRNA mimics NC组:IPC前于培养基中加miRNA mimics NC,其余步骤同IPC+OGD组。于末次恢复氧葡萄糖供应1 d时,应用CCK8法评价神经元的活性,研究miR-330-5p mimics能否抑制IPC所诱导的OGD耐受。7.脑缺血预处理对miR-330-5p表达的影响采用大鼠四血管闭塞法全脑缺血模型,分组如下（n=5）:（1）sham组;（2）CIPC组。于末次缺血后2 d时取大鼠海马CA1区,qRT-PCR检测miR-330-5p的表达。8.过表达miR-330-5p对脑缺血耐受的影响采用大鼠四血管闭塞法全脑缺血模型,分组如下（n=5）:（1）Sham组;（2）IS组;（3）CIPC+IS组;（4）CIPC+IS+miR-330-5p组:在CIPC之前侧脑室注射miR-330-5p腺相关病毒,其余步骤同CIPC+IS组;（5）CIPC+IS+miR-NC组:CIPC前侧脑室注射miR-NC腺相关病毒阴性对照,其余步骤同CIPC+IS组。末次缺血后7 d取材,硫堇染色观察神经元的存活情况,观察miR-330-5p能否阻断脑缺血耐受诱导。9.过表达miR-330-5p对GLT-1表达的影响采用大鼠四血管闭塞法全脑缺血模型,分组如下（n=5）:（1）Sham组;（2）CIPC组;（3）CIPC+miR-330-5p组:在CIPC之前侧脑室注射miR-330-5p腺相关病毒,其余步骤同CIPC组;（4）CIPC+miR-NC组:CIPC前侧脑室注射miR-NC腺相关病毒阴性对照,其余步骤同CIPC组。于末次缺血后2 d时取大鼠海马CA1区,通过western blot观察GLT-1的表达。结果:1.IPC处理导致星形胶质细胞miRNA表达谱显著变化高通量测序结果显示,与对照组相比,IPC组miRNA有91个显著下调,134个显著上调。通过对3次独立培养的星形胶质细胞进行qRT-PCR验证,证实miRNA测序结果可信。2.预测miRNAs与lncRNA BIRF及GLT-1 mRNA的结合位点通过RNAhybride数据库,预测出miR-330-5p和lncRNA BIRF及GLT-1 mRNA各1个结合位点,miR-22-3p和lncRNA BIRF及GLT-1 mRNA各1个结合位点。3.过表达miR-330-5p可显著降低GLT-1蛋白表达Western blot结果显示,预先转染miR-330-5p mimics,可显著降低IPC后GLT-1蛋白表达,而预先转染miR-22-3p mimics则不会显著影响IPC后GLT-1蛋白表达。因此选择miR-330-5p用于后续实验。4.miR-330-5p可与GLT-1 mRNA特异性靶向结合双荧光素酶报告基因分析证实,GLT-1-CDS区存在miR-330-5p的直接结合靶点。与其他组相比,转染GLT-1-wt和miR-330-5p mimics的细胞显示出相对荧光素酶活性显著降低。5.IPC下调miR-330-5p表达qRT-PCR结果显示,与对照组相比,IPC组miR-330-5p表达明显下降（P＜0.05）。6.过表达miR-330-5p抑制OGD耐受诱导CCK8实验结果显示,OGD后神经元细胞活性明显下降;IPC可保护神经元,提高细胞活性;而预先转染miR-330-5p mimics后再进行IPC+OGD处理,则细胞活性再次降低。提示过表达miR-330-5p可抑制IPC所诱导的OGD耐受。7.脑缺血预处理明显降低miR-330-5p表达qRT-PCR结果显示,与Sham组相比,CIPC组大鼠miR-330-5p表达明显降低（P＜0.05）。8.过表达miR-330-5p抑制脑缺血耐受诱导硫堇染色结果显示,CIPC可诱导脑缺血耐受,减轻神经元死亡,但预先侧脑室注射miR-330-5p腺相关病毒则会抑制此作用。9.过表达miR-330-5p可抑制脑缺血耐受诱导过程中GLT-1蛋白表达Western blot结果表明,CIPC前经侧脑室注射miR-330-5p腺相关病毒过表达miR-330-5p,会抑制CIPC引起的GLT-1升高。因此证明miR-330-5p可反向调控GLT-1的表达。小结:IPC处理后miRNA表达谱发生明显差异性变化,miR-330-5p表达下降,过表达miR-330-5p通过直接靶向结合GLT-1,下调GLT-1表达,从而抑制脑缺血预处理诱导脑缺血耐受。第三部分lncRNA BIRF/miR-330-5p/GLT-1三者相互作用参与脑缺血预处理诱导脑缺血耐受目的:1.分子水平论证lncRNA BIRF/miR-330-5p/GLT-1三者互作靶向关系。2.细胞水平验证lncRNA BIRF/miR-330-5p/GLT-1构成的ceRNA互作关系可调控GLT-1表达,影响OGD耐受。方法:1.论证miR-330-5p与lncRNA BIRF存在靶向关系应用双荧光素酶报告基因分析技术论证miR-330-5p与lncRNA BIRF靶向结合位点。构建包含lncRNA BIRF与miR-330-5p结合位点序列的双荧光素酶报告基因载体（野生型和突变型）,与miR-330-5p mimics共转染至HEK293-T细胞。分组如下（n=3）:（1）miRNA mimics NC+BIRF-wt;（2）miR-330-5p mimics+BIRF-wt;（3）miRNA mimics NC+BIRF-mut;（4）miR-330-5p mimics+BIRF-mut。于转染后24 h时间点使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶的荧光强度,从而确定lncRNA BIRF可以和miR-330-5p靶向结合。2.论证lncRNA BIRF可与GLT-1 mRNA竞争性结合miR-330-5p采用HEK293-T细胞,进行双荧光素酶报告基因分析,论证lncRNA BIRF可以竞争性结合miR-330-5p,从而解除miR-330-5p对GLT-1 mRNA的抑制作用。将lncRNA BIRF的序列构建到pc DNA3.1真核表达载体中,使用lipofectamine3000将该表达载体、含有GLT-1结合靶点的双荧光素酶报告基因、miR-330-5p mimics三者共转染入HEK293-T细胞,对照组只转染miR-330-5p mimics和GLT-1双荧光素酶报告基因。分组如下（n=3）:（1）miR-330-5p mimics+GLT-1-wt;（2）miR-330-5p mimics+GLT-1-wt+pc DNA3.1空载体;（3）miR-330-5p mimics+GLT-1-wt+pc DNA3.1-BIRF。于转染后24 h时间点使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶的荧光强度,证明lncRNA BIRF可以解除miR-330-5p对GLT-1 mRNA的抑制作用。3.观察miR-330-5p inhibitor能否阻断下调lncRNA BIRF表达对OGD耐受诱导的影响分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为7组（n=3）:（1）Control组;（2）OGD组;（3）IPC+OGD组;（4）IPC+OGD+siRNA NC组;（5）IPC+OGD+lncRNA BIRF siRNA组;（6）IPC+OGD+lncRNA BIRF siRNA+miR-330-5p inhibitor组:IPC前于培养基中加入lncRNA BIRF siRNA+miR-330-5p inhibitor,其余步骤同IPC+OGD组;（7）IPC+OGD+lncRNA BIRF siRNA+miRNA inhibitor NC组:IPC前于培养基中加lncRNA BIRF siRNA+miRNA inhibitor NC,其余步骤同IPC+OGD组。于末次恢复氧葡萄糖供应1 d时,应用CCK8法评价神经元的细胞活性。4.观察miR-330-5p inhibitor能否阻断下调lncRNA BIRF表达对GLT-1蛋白表达的影响分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为5组（n=3）:（1）Control组;（2）IPC组;（3）IPC+lncRNA BIRF siRNA组;（4）IPC+lncRNA BIRF siRNA+miR-330-5p inhibitor组:IPC前于培养基中加入lncRNA BIRF siRNA+miR-330-5p inhibitor,其余步骤同IPC组;（5）IPC+lncRNA BIRF siRNA+miRNA inhibitor NC组:IPC前于培养基中加lncRNA BIRF siRNA+miRNA inhibitor NC,其余步骤同IPC组。于末次恢复氧葡萄糖供应后6 h时收集星形胶质细胞,通过western blot研究对GLT-1蛋白表达的影响。结果:1.miR-330-5p可与预测的lncRNA BIRF位点直接靶向结合双荧光素酶实验结果表明,与miRNA mimics NC+BIRF-wt组相比,miR-330-5p mimics可抑制BIRF-wt荧光蛋白表达,荧光活性降低,但如果把lncRNA BIRF位点突变后则此抑制作用会消失。2.lncRNA BIRF可以解除miR-330-5p对GLT-1 mRNA的抑制作用由第二部分实验结果4可知miR-330-5p与GLT-1荧光素酶质粒结合可抑制荧光蛋白表达,在此基础上,将lncRNA BIRF过表达质粒pc DNA3.1-lncRNA BIRF一同转染至HEK293-T细胞,可发现荧光蛋白再次表达。结果证明lncRNA BIRF可靶向结合miR-330-5p,逆转miR-330-5p对GLT-1 mRNA的抑制作用。3.miR-330-5p inhibitor可阻断下调lncRNA BIRF表达对OGD耐受诱导的抑制作用第一部分结果4证明lncRNA-BIRF siRNA可抑制OGD耐受诱导,细胞活性显著下降,在此基础上,向星形胶质细胞同时转染miR-330-5p inhibitor,可阻断lncRNA BIRF siRNA的作用,使细胞活性升高。因此可证明下调lncRNA BIRF抑制OGD耐受的作用可被miR-330-5p阻断。4.miR-330-5p inhibitor能阻断下调lncRNA BIRF表达对GLT-1蛋白表达的影响第一部分结果5证明lncRNA BIRF siRNA可抑制GLT-1蛋白表达,在此基础上,向星形胶质细胞同时转染miR-330-5p inhibitor,可阻断lncRNA BIRF siRNA的作用,GLT-1蛋白表达升高。因此可证明下调lncRNA BIRF抑制GLT-1表达的作用是通过miR-330-5p发挥的。小结:lncRNA BIRF/miR-330-5p/GLT-1可通过ceRNA机制参与脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受。结论:1.IPC处理后lncRNA的表达谱发生明显差异性变化,其中lncRNA BIRF表达升高,通过上调GLT-1表达促进脑缺血预处理诱导脑缺血耐受。2.IPC处理后miRNA表达谱发生明显差异性变化,miR-330-5p表达下降,过表达miR-330-5p通过直接靶向结合GLT-1,下调GLT-1表达,从而抑制脑缺血预处理诱导脑缺血耐受。3.lncRNA BIRF/miR-330-5p/GLT-1可通过ceRNA机制参与脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受。上述结果表明,脑缺血预处理可引起ncRNA表达谱发生明显差异性表达,lncRNA BIRF/miR-330-5p/GLT-1构成的ceRNA调控机制在脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受过程中发挥重要作用。