第一章七氟烷预处理对大鼠肝、脑及心脏基因表达谱的影响　　目的:利用DNA芯片方法探讨七氟烷预处理对大鼠肝脏、脑及心脏基因表达谱的影响。方法:七氟烷预处理大鼠后，DNA微阵列法检测大鼠肝、脑及心脏基因表达差异，qRT-PCR验证其中三个差异表达的基因。结果:根据事先制定的数据处理标准，2％的七氟烷预处理90分钟后，所有组织表现出基因表达差异。在这些表达差异的基因里有34个基因在至少两个组织中呈现同一方向的表达变化，其中19个上升，15个下降。本研究选取了三个在肝脏中表达有影响的三个基因进行qRT-PCR试验，qRT-PCR实验结果与DNA微阵列结果一致。结论:鉴别了34种在大鼠肝脑心脏经七氟烷预处理后表达差异的基因。　　第二章金属硫蛋白Ⅰ+Ⅱ在七氟烷预处理原代培养的大鼠神经元过程中的作用　　目的:探讨七氟烷延迟预处理在大鼠原代培养神经元中的保护特性及金属硫蛋白Ⅰ+Ⅱ(Metallothionein，MT-Ⅰ+Ⅱ)在麻醉延迟预处理介导的保护作用中的作用机制。　　方法:1）原代神经元培养;2）七氟烷预处理;3）建立体外氧一葡萄糖剥夺模型;4)qRT-PCR检测MT-Ⅰ+Ⅱ mRNA表达水平;5）乳酸脱氢酶(LDH)检测神经元毒性;6）微管相关蛋白-2/胶质纤维酸性蛋白检测神经元毒性;7）免疫荧光检测MTⅠ+Ⅱ的神经元中的定位情况;8)siRNA抑制MTⅠ+Ⅱ的表达;9）外源MTⅠ+Ⅱ蛋白转染。　　结果:1）1.5％七氟烷预处理3小时组缺糖缺氧后(Oxygen-Glueose Deprivation OGD)在任一时间点对神经元毒性明显小于没有预处理组(P＜0.05)。七氟烷预处理对OGD诱导的神经元损伤的保护作用在24小时时是11.7±8.2％(n=22);保护作用在72小时时达到顶峰37.5％±4.3％(n=22);在96小时时保护作用仍然有31.9％±5.2％;n=29）。2）OGD3小时对神经元和神经胶质都有毒性作用，但是神经元的毒性作用更大，其生存率是39.6±7.8％，而神经胶质在OGD3h后生存率是80.2±10.5％。但是七氟烷预处理组，神经元存活率恢复至85.3±9.2％，存活率上升程度超过125％，而神经胶质存活率上升程度只有22％。对神经元进行两因素方差分析表明，OGD和七氟烷预处理(APC)的主效应显著(P＜0.01)，且交互作用显著(P＜0.01)。方差分析表明七氟烷预处理能够有效抵抗OGD介导的神经元死亡作用，OGD组和APC+OGD组两组间T检验也有差异，P＜0.01，也能证实这一结果。神经胶质的两因素方差分析结果则发现OGD和七氟烷预处理的主效应显著(P＜0.05)，但两组间交互作用无差异(P=0.53)，这说明七氟烷预处理不能保护神经胶质拮抗OGD介导的损伤作用。3）外源性MTⅠ+Ⅱ蛋白转染原代培养的神经元后，3小时OGD处理，LDH释放实验结果表明与对照组相比（转染胰岛素氧化β链），MTⅠ+Ⅱ对GD诱导的神经元损伤的保护作用从3.1±1.4％(转染1.6μM MTⅠ+Ⅱ，P＞0.05，n=10)上升至34.8±9.2％(转染3.2μM MTⅠ+Ⅱ,P＜0.001,n=10)。4) MTImRNA表达水平在预处理12小时后达到峰值，为未处理组的2.2±0.8倍，在预处理后6、12小时与未处理组表达有统计学差异(P＜0.05);MTⅡ mRNA表达水平在预处理12小时后达到峰值，为未处理组的2.9±1.1倍，在预处理后3、6、12小时与未处理组表达有统计学差异(P＜0.05)。5)无义siRNA转染对七氟烷预处理保护原代神经元作用影响不大，为19.4±3.5％。两因素方差分析表明，MTⅠ+Ⅱ基因沉默(P＜0.05)和七氟烷预处理(P＜0.01)主效应显著，但两者间交互作用无统计学意义(P=0.564)，这表明部分抑制MTⅠ+Ⅱ基因表达并不能有效降低七氟烷预处理拮抗OGD介导神经元损伤作用。但是在未预处理对照组，与转染无义siRNA相比，转染MT-Ⅰ+Ⅱ siRNA显著加重了OGD处理对神经元的损伤作用，这表明细胞MT-Ⅰ+Ⅱ水平低于正常水平时，OGD更加容易引起神经元损伤。6)与源自未经预处理的鼠原代神经元相比，源自经预处理的大鼠原代神经元能够有效对抗OGD诱导的神经元损伤(22.5±3.4％; n=16，P＜0.05)。7)单克隆MTⅠ+Ⅱ主要分布于MAP2标记的神经元。　　结论:1）建立经七氟烷处理后金属硫蛋白Ⅰ+Ⅱ时间变化表。2）在麻醉剂延迟预处理过程中，神经元细胞和神经胶质细胞都得到保护。3）神经元既能容易遭受葡萄糖剥夺引起的损伤，这一损伤作用又更容易受到缺血预处理作用的保护。4）基因敲除研究表明金属硫蛋白参与了七氟烷介导的延迟预处理过程。5）直接转染外源性金属硫蛋白，表明金属硫蛋白是预防缺血性损伤的有效手段。　　第三章金属硫蛋白Ⅰ+Ⅱ作为氧化应激传感器在七氟烷预处理保护过程中的作用机制　　目的:探讨了经吸入麻醉剂七氟烷、活性氮类一氧化氮及超氧化自由基预处理之后，金属硫蛋白作为氧化应激传感器发挥作用的机制。　　方法:1）原代神经元培养;2）七氟烷预处理;3）体外氧—葡萄糖剥夺模型的建立;4）乳酸脱氢酶(LDH)检测神经元毒性;5）神经元核蛋白提取;6）Western blot检测MTF-1的表达。　　结果:1）200μM SNAP预处理能够显著提高神经元拮抗OGD损伤，保护率为（38.2±2.9％;n=28），与未经预处理组相比有统计学差异(p＜0.001;n=28)。同样浓度的SNAP经37℃，24小时降解处理后再预处理神经元，结果表明SNAP降解后，保护率显著降低只有7.9±4.1％(n=14)，与对照组无统计学差异(P=0.4)，与未降解SNAP有统计学差异(p＜0.01;n=14)。巴拉刈(yi)预处理能够显著提高神经元拮抗OGD损伤，保护率为（23.8±6.2％;n=14），与未经预处理组相比有统计学差异(p＜0.01;n=14)。为了确保拮抗OGD损伤的保护作用只是来自相应的预处理，在OGD处理评价细胞毒性实验前，更换神经元培养基。LDH实验结果表明SNAP、巴拉刈及降解型SNAP与正常对照组相比，LDH水平差异不大，分别是正常组的(75.2±2.6％，p=0.18，n=6)、(82±3.1％; p=0.26，n=6)及(65.5±1.1％;p＜0.05; n=6)。SNAP、巴拉刈预处理后2小时，与未预处理组相比，MTF-1核定位分别提高了74±18％和224±85％;n=3，），而降解型SNAP预处理对提高MTF-1核定位程度不明显，只有16±5.8％;n=3，)。2)与未预处理相比，2.5％七氟烷预处理2小时对神经元拮抗4小时OGD处理损伤作用的保护率为(31.6±3.4％;p＜0.001;n=15)。在七氟烷预处理前，用0.1mM诱导性一氧化氮抑制剂氨基胍（aminoguanidine，AG）或者1.0mM过氧化物歧化酶Mn-TBAP(mimetic manganese(Ⅲ) tetrakis(4-benzoic acid) porphyrin chloride)干预2小时后，七氟烷预处理对神经元拮抗OGD诱导损伤作用的保护率分别下降至5.4±3.7％(p=0.47; n=18)、6.2±4.1％(p=0.28;n=14)。Western blot实验表明，七氟烷预处理后与对照组比较，MTF-1核定位程度增加了53±1.8％(p＜0.001;n=3)。而在氨基胍和Mn-TBAP干预组，MTF-1核定位增加程度分别为-6.2±3.9％(n=3)和17±4.2％(n=3)。3)七氟烷、SNAP及巴拉刈预处理对MT-Ⅰ+Ⅱ基因敲除的神经元拮抗OGD诱导损伤的保护率分别为(0.75±0.2％;n=22;p=0.80),(-1.43±0.9％; n=24,p=0.66),and(-5.8±3.2％; n=14,p=0.31)。LDH释放实验检测证实单独预处理对MT-Ⅰ+Ⅱ基因敲除的神经元毒性作用不明显，单独七氟烷、SNAP及巴拉刈预处理的神经毒性作用分别为:(13±7.9％;n=8; p=0.27)、(-4.0±1.5％;n=8;p=0.57; n=8)及（9±4.0％;n=8; p=0.21），差异均无统计学差异。Western结果表明，七氟烷、SNAP及巴拉刈预处理组MT-Ⅰ+Ⅱ基因敲除的神经元细胞核中MTF-1的表达水平分别高出对照组3.0±9.7％，18±3.0％，and31±2.7％(n=3)。　　结论:1.在麻醉剂延迟预处理过程中，阻止NO或者过氧化物的产生，降低了保护作用和MTF-1的核定位;2.NO和过氧化物激动剂单独作用也产生对神经元培养物的保护作用，也相应增加了MTF-1的核定位;3.将金属硫蛋白Ⅰ+Ⅱ的基因敲除，不但能够降低由NO和过氧化物介导的保护作用，同时也能降低七氟烷预处理介导的核内MTF-1的增加水平。