【摘 要】
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天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线。TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键激酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1在伪狂犬病毒复制过程中的作用,本试验利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术构建了猪TBK1基因稳定敲除猪肾细胞系。首先针对TBK1基因外显子2区设
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天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线。TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键激酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1在伪狂犬病毒复制过程中的作用,本试验利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术构建了猪TBK1基因稳定敲除猪肾细胞系。首先针对TBK1基因外显子2区设计3条单链向导RNA(Single guide RNA,sgRNA)并在退火后将其连接到经Bsmb Ⅰ核酸内切酶切割过的载体质粒LentiCRISPR v2上得到重组质粒,然后将重组质粒和pMD2.G、psPAX2两种包装质粒共转染至人胚肾细胞HEK293T/17获取慢病毒并感染猪肾细胞(Porcine kidney 15,PK15)。用含嘌呤霉素(Puromycin)的培养基压力筛选获得TBK1基因敲除多克隆细胞系后提取细胞基因组,PCR扩增目的片段并将扩增产物退火,然后用T7核酸内切酶检测三条sgRNA的编辑效率。选取编辑效率最高的多克隆细胞系通过有限稀释法,获得TBK1基因敲除单克隆细胞系(PK15-TBK1-/-)。随后利用CCK-8检测敲除TBK1基因对PK15细胞活力的影响;通过PRV-GFP感染细胞后利用荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测GFP荧光蛋白表达强度及荧光细胞阳性率;PRV-QXX感染细胞后利用RT-qPCR检测PRV gB、gE、TK和IL-1β、IFN-β、ISG15基因mRNA表达水平;Western Blot检测PRV gB、gE蛋白表达水平以及TCID50滴度测定子代病毒的感染力来综合评价PK15-TBK1-/-细胞系的功能。经过DNA测序和序列比对,可以证明重组质粒构建成功。T7 检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均有显著编辑。选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1多克隆细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1 基因的单克隆细胞,选取4号细胞株进行后续试验。结果显示敲除TBK1基因对PK15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明敲除TBK1基因促进PRV-GFP复制。RT-qPCR结果显示PRV-QXX感染后PK15-TBK1-/-细胞中 PRV gB、gE、TK mRNA表达高于PK15 细胞,而IL-1β、IFN-β、ISG15 mRNA表达低于PK15细胞。Western Blot检测显示,PRV-QXX感染相同时间后PK15-TBK 1-/-细胞中PRV gB和PRV gE蛋白表达高于PK15细胞。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK15细胞复制后病毒滴度为106.8 TCID50·0.1 mL-1,而在PK15-TBK1-/-细胞中复制后病毒滴度为108.5 TCID50·0.1 mL-1。以上结果表明,该试验成功构建了稳定敲除TBK1基因的PK15细胞系,该细胞系为深入研究PRV感染机制提供了有效工具。
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