论文部分内容阅读
硫肽类抗生素是一类由微生物次级代谢产生的富含硫元素且被高度后修饰的聚噻（噁）唑多肽类天然产物,具有良好的生物活性。但由于其水溶性差等原因,导致该类抗生素在临床上的应用受到限制。因此,在了解其生物合成机制的基础上,通过合理的生物工程改造来获得硫肽类似物的方法成了生物学家们关注的焦点。双环硫肽Nosiheptide（NOS）和Thiostrepton（TSR）作为该家族的明星分子,具有良好的生理活性,如抗菌、抗疟、抗癌等,因此被广泛的研究和报道。NOS侧环结构中包含一个吲哚酸（4-methyl-2-indolyl acid,MIA）单元,TSR侧环包含一个喹萘啶酸（quinaldic acid,QA）单元,这两个单元均来自于L-色氨酸,并独立于前体肽之外。因此,可以向MIA或QA单元合成阻断的突变株中喂养他们的类似物获得相应的硫肽类似物。根据之前报道,对MIA和QA单元进行微调可以得到生理活性提高的硫肽类似物。本文以MIA单元合成阻断的突变株ΔnosL为研究对象,利用突变生物合成方法获得NOS类似物。首先,我们化学合成了9种MIA类似物,为了得到更多样的MIA类似物,我们又购买了13种MIA衍生物。然后,以负责MIA单元形成的nosL基因缺失的突变株ΔnosL为基底菌进行发酵喂养MIA衍生物,在所有喂养的22种发酵液中,检测到了10种成熟的双环NOS类似物:5’-F-NOS,6’-F-NOS,5’-Cl-NOS,6’-Cl-NOS,5’-CH3-NOS,9’-CH3-NOS,O-NOS,S-NOS-1,S-NOS-2,S-NOS-3;9种单环NOS类似物:5’-F-NOSint,6’-F-NOSint,6’-Cl-NOSint,6,7-2Cl-NOSint,7’-F-NOSint,7’-Cl-NOSint,5,6-2-F-NOSint,5’-F-6’-Cl-NOSint,5’-O-NOSint。当MIA单元中的氢被更大的基团:-NO2、-CF3、-Ph取代时不能得到任何NOS相关的化合物。从喂养结果可以看出,MIA取代基的体积和取代位点均是影响其上载到大环骨架的关键因素。硫肽结构中F原子的存在通常可以使其生理活性提高,在我们喂养得到的NOS类似物中,6’-F-MIA可以更好的被大环骨架容忍,同时得到两种NOS类似物。根据NOS在发挥抗菌活性时MIA单元的独特贡献,我们希望通过改变MIA结构改善NOS的活性。所以,本实验选择向突变株ΔnosL发酵液中大量喂养6’-F-MIA并分离相应NOS类似物。在实验开展初期,我们采用实验室传统的发酵方法:在一级发酵菌种转接二级发酵时喂养MIA类似物,但只得到了质谱水平的NOS类似物。为了提高NOS类似物的产率,我们对发酵条件进行了摸索,最终确定采用一级发酵进行喂养,该条件使发酵时间缩短为原来的一半,产率达到HPLC分析水平,大大提高了发酵效率。在完成ΔnosL突变株的大量发酵喂养后,通过硅胶柱层析、半制备HPLC分离方法,从菌体中分离纯化得到双环NOS类似物6’-F-NOS和单环NOS中间体6’-F-NOSint,通过高分辨质谱和核磁谱图对其结构进行了分析鉴定。在抗菌活性测试中,我们选择耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSAATCC43300）和耐万古霉素的肠球菌（VRE ATCC29212,VRE ATCC51299,VRE ATCC51559）为对象研究6’-F-NOS和6’-F-NOSint的活性。可惜的是,化合物6’-F-NOS的抗菌活性相比NOS均略有降低,6’-F-NOSint的抗菌活性则完全丧失。从以上结果可以看出,MIA单元的修饰不仅可以影响NOS的抗菌活性还可以影响他的水溶性,这对开发生理活性提高的新的NOS类似物带来了困难。开环化合物6’-F-NOSint活性的丧失,说明侧环闭环的重要性。我们推测,6’-F-NOSint侧环的开环可以提高其结构自由度,影响6’-F-NOSint与靶标的结合。总之,本实验从突变生物合成角度出发,向MIA合成阻断的突变株ΔnosL中喂养6’-F-MIA,得到了成熟的双环6’-F-NOS和侧环开环的6’-F-NOSint。这项工作使我们对NOS的生物合成机理有了进一步的了解,并为NOS类似物的生物合成奠定了基础。