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鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus,SVCV）诱发的鲤春病毒血症（Spring viremia of carp,SVC）是一种严重危害鲤科鱼类的水生动物病毒性疾病,具有发病急、传染性强、致死率高等特点,给水产养殖业造成巨大的经济损失。目前,由于疫苗免疫防控的缺乏和局限,药物防控仍然是病害防控的有效手段。医用抗病毒药物盐酸吗啉胍、利巴韦林等被禁用以来,抗病毒药物在生产中应用寥寥无几,因此水产抗病毒药物的创新研究受到了极大的关注,也是产业的迫切需求。中草药具有易降解、环境友好等优点,具有抑菌、驱虫、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性,是药物创新的出发点和药源库。本研究首先测定牛蒡子、川芎等37种中草药的抗SVCV活性,发现抗病毒活性最高的为牛蒡子,其活性成分为牛蒡子苷元（Arctigenin,ARG）;进一步对27种合成的ARG衍生物进行活性评价;并通过RNA-seq转录组学分析等手段,深入研究衍生物的抗病毒机制,以期为开发新型抗SVCV药物提供理论依据。本研究取得结果如下:1.中草药及活性成分抗SVCV活性研究以最大安全浓度筛选具有抗SVCV活性的中草药,实时定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-q PCR）检测结果显示:牛蒡子、川芎、白芍等7种中草药对SVCV的抑制率超过90%,其中牛蒡子对SVCV的抑制作用最佳。采用高效液相色谱对粗提物分析发现:牛蒡子苷（Arctiin,ART）和ARG是牛蒡子中的主要成分,含量分别为233.68 mg/g和12.28 mg/g;ART和ARG抗病毒活性研究结果显示:ARG显著抑制SVCV诱导的细胞病变,说明ARG可能是牛蒡子的主要活性成分;通过RT-q PCR、病毒滴度检测和细胞结构观察,发现ARG显著降低了病毒滴度并减轻SVCV对细胞结构的损伤,其半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)为0.81μM,证实了ARG具有体外抗SVCV活性。ARG抗SVCV活性在体试验研究显示:试验鱼脾脏和肾脏中SVCV基因表达量在用药后第1天显著降低,ARG治疗组鱼体内病毒滴度显著低于病毒组,且累计存活率比病毒组提高了20%。以上研究证实,ARG可以作为开发抗SVCV药物的先导化合物。2.牛蒡子苷元衍生物抗SVCV活性研究采用EPC细胞体外抗病毒活性筛选模型,对以ARG为先导化合物合成的27种衍生物的构效关系研究发现:18种衍生物具有抗SVCV活性,其中12种为含氮杂环类衍生物;8、20、25和27号衍生物IC50值低于ARG（0.81μM）,27号衍生物4-（2-甲基咪唑）辛氧基牛蒡子苷元（MON）的IC50值最小,为0.18μM,抗病毒活性最佳。通过MON注射给药的方法证实了其在体抗病毒活性优于ARG,MON在SVCV感染后第6天仍具有降低病毒滴度的作用,在脾脏和肾脏中的抗病毒活性维持到第7天,有效改善了SVCV感染引起的组织损伤,且MON治疗组的存活率较SVCV感染组增加了36.7%。由此可见,衍生物MON在细胞水平和个体水平的抗SVCV活性均优于ARG。3.衍生物MON对宿主细胞转录组水平的影响转录组测序（RNA-seq）结果发现:（1）与对照组相比,MON处理组共获得10776个差异显著基因,包括4538个上调基因以及6238个下调基因;对比SVCV感染组,MON治疗组共获得10881个差异基因,其中4314个基因上调,6567个基因下调;通过分析上调和下调倍数最高的前20个基因发现:两个对比组（MON处理组与对照组对比,MON治疗组与SVCV感染组对比）中均包含与能量代谢相关的基因,表明MON可能影响宿主细胞早期能量代谢;（2）GO注释结果表明,一系列与细胞周期相关的进程在衍生物MON作用后显著改变;（3）KEGG通路分析发现,衍生物MON作用后的差异表达基因富集的通路中最显著的为细胞周期通路,与能量代谢相关的PPAR通路也在两个对比组中显著富集。以上结果表明MON在SVCV感染初期主要影响细胞周期和能量代谢调控相关的基因和通路。4.衍生物MON对细胞周期和ATP合成调控研究基于转录组学结果,测定衍生物MON对EPC细胞的细胞周期和ATP合成的影响,探究该化合物的抗SVCV作用机制。试验结果显示,MON处理使EPC细胞周期G2/M期细胞比例显著增加,显著抑制SVCV诱导的S期阻滞;MON在处理6 h和12 h均显著抑制EPC细胞ATP合成。采用线粒体呼吸链复合物抑制剂降低ATP合成发现,SVCV诱导的细胞周期S期阻滞和SVCV的增殖均被抑制,表明降低宿主细胞ATP合成能有效抑制SVCV诱导的细胞周期S期阻滞,干扰SVCV增殖。此外,通过构建SVCV N蛋白真核表达质粒p EGFP-SVCV-N并进行细胞转染发现,MON显著地抑制了p EGFP-SVCV-N的表达,表明MON能够影响与细胞周期调控相关的N蛋白的表达,进一步证实了MON对细胞周期的调控作用。综上,衍生物MON在SVCV复制前期通过降低EPC细胞的ATP合成,抑制SVCV诱导的细胞周期S期阻滞,干扰病毒增殖。5.衍生物MON对SVCV诱导的细胞凋亡调控研究通过细胞荧光染色的方法检测细胞凋亡相关形态学指标发现:SVCV感染诱导EPC细胞凋亡小体形成及微丝微管系统解聚,出现典型的细胞凋亡特征,而衍生物MON处理后,EPC细胞与对照组相比无明显差异,未出现细胞凋亡特征;采用流式细胞术对细胞凋亡的程度检测结果显示:SVCV感染48 h后,43.7%的细胞发生凋亡,经MON处理后,凋亡细胞的比例降低至8.7%;凋亡相关蛋白和酶活性检测结果表明,衍生物MON抑制促凋亡蛋白bax的表达,促进抗凋亡蛋白bcl-2的表达,并有效恢复caspase8,9和3蛋白的表达和酶活性;通过测定呼吸链复合物抑制剂对细胞凋亡的影响发现,MON的抗凋亡作用与其对ATP合成的抑制作用有关;进一步通过病毒释放检测结果显示:细胞上清液中的病毒滴度在MON处理后显著降低,表明MON处理能够减少病毒粒子的释放量。综上,衍生物MON在SVCV复制后期通过抑制SVCV诱导的细胞凋亡发生,减少病毒粒子的释放量。综上所述,以ARG为先导化合物合成的衍生物MON抗SVCV作用机制主要表现为:在病毒复制前期通过降低宿主细胞ATP合成,抑制SVCV诱导的细胞周期S期阻滞,从而干扰病毒增殖;在病毒复制后期通过抑制SVCV诱导的细胞凋亡,减少病毒粒子的释放量。因此,本研究对中草药抗SVCV活性的研究具有重要意义,为抗SVCV新型药物的研发提供了理论依据。