柑桔全爪螨Panonychus citri(McGregor)是重要的农业害螨,在桔园发生危害严重,影响柑桔的产量和品质。目前,对于柑桔全爪螨的防治仍以化学药剂为主,然而由于柑桔全爪螨发育历期短、世代重叠、繁殖速度快等特性以及田间杀螨剂的不合理使用,导致其抗性问题日益严重,因此发掘柑桔全爪螨防控新靶标以及研发新型杀螨剂显得尤为重要和迫切。近年来,基于发掘害虫(螨)生长发育相关的分子靶标并研发新型杀虫(螨)剂成为研究的热点领域。蜕皮激素是调控昆虫生长发育的重要微量化学物质,昆虫通过将取食获得的植物甾醇或动物胆固醇经由一系列Halloween基因编码的酶的催化代谢,氧化成为具生物活性的20E,20E与蜕皮激素受体及超气门蛋白USP形成的异源二聚体相结合,启动20E信号传递,并产生一系列级联反应,影响细胞的增殖、分化及程序性死亡从而调控生长发育及蜕皮等整个过程。然而,关于螨类蜕皮激素的研究相对滞后,对柑桔全爪螨蜕皮激素合成及其信号传导机制的研究更是鲜有报道。本学位论文以柑桔全爪螨为研究对象,围绕蜕皮激素合成和信号传导分子机制这一科学问题,在全面挖掘柑桔全爪螨蜕皮激素合成和信号通路同源基因信息的基础上,筛选参与柑桔全爪螨蜕皮过程的差异表达的关键基因,解析这些基因在不同发育阶段蜕皮前后的表达模式,分析其在蜕皮过程的功能,分析鉴定蜕皮激素活性物质,定位蜕皮激素合成和信号通路基因的组织,解析蜕皮激素受体复合物EcR-RXR1/RXR2的结合模式。研究结果对于揭示柑桔全爪螨蜕皮激素合成与信号通路的分子调控机制以及基于该分子调控机制发掘新靶点和研发新型杀螨剂具有重要的理论和实践价值。主要研究结果如下:1柑桔全爪螨蜕皮调控相关基因信息挖掘利用高通量测序技术对柑桔全爪螨幼螨至成螨生长发育过程3次蜕皮前后样品进行转录组测序,分析发现共有4456个差异基因。GO聚类分析结果显示大部分差异基因与激素合成、蛋白质合成与吸收、以及营养物质合成和运输有关。KEGG通路分析结果显示蜕皮激素通路基因、几丁质酶基因、表皮蛋白基因和ABC转运蛋白基因的富集比例最高。进一步比对分析3次蜕皮过程的差异基因发现幼螨至前若螨与前若螨至后若螨的蜕皮过程中无共同的差异表达基因,而前若螨至后若螨和后若螨至成螨的蜕皮过程则有50%相同的差异表达基因,暗示幼螨至前若螨的蜕皮过程与前若螨至后若螨以及后若螨至成螨蜕皮过程的分子调控机制存在差异。比较分析幼螨至前若螨蜕皮过程以及前若螨至后若螨蜕皮过程中差异表达基因发现幼螨至前若螨蜕皮过程中高表达基因与前若螨至后若螨蜕皮过程中低表达基因存在大量基因重合现象;反之,幼螨至前若螨蜕皮过程中低表达基因与前若螨至后若螨蜕皮过程中高表达基因具有同样的结果,暗示幼螨至前若螨蜕皮过程与前若螨至后若螨蜕皮过程的分子调控中拥有共调控基因但基因表达的时间动态存在差别。上述结果为研究柑桔全爪螨生长发育调控网络奠定了分子基础。2柑桔全爪螨蜕皮激素合成与信号通路关键基因鉴定2.1基于柑桔全爪螨基因组数据库鉴定蜕皮激素合成和信号通路同源基因基于柑桔全爪螨不同发育阶段转录组和全基因组数据联合分析,共获得15个蜕皮激素合成和信号通路同源基因的cDNA全长序列,包括5个蜕皮激素合成酶基因PcSro、PcSpo、PcDib、PcSad和PcShd,其中的4个P450基因具有保守结构域:WxxxR(Helix-C)、GxR/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFXPE/DRF(PERF motif)以及血红蛋白结合位点PFxxGxRxCxG/A;8个蜕皮激素信号通路核受体基因PcEcR、PcRXR1、PcRXR2、PcE75、PcE78、PcHR3、PcHR38和PcFTZ-F1,均具有典型的核受体结构域:DNA结合域和配体结合域、在C域中存在2个锌指结构;以及2个转录因子PcE74和PcKr-h1。2.2柑桔全爪螨蜕皮激素合成和信号通路基因在各次蜕皮前后的表达模式利用qRT-PCR技术解析柑桔全爪螨蜕皮激素合成和信号通路14个基因在各次蜕皮前后的表达模式,结果显示,PcSpo、PcDib和PcRXR2在各次蜕皮后8 h表达量升高,进入蜕皮8 h表达量降低;与之相反,PcRXR1、PcE78和PcFTZ-F1在蜕皮后8 h表达量降低,在进入蜕皮8 h表达量升高。上述基因在柑桔全爪螨的不同发育阶段呈现两种相反的“锯齿”状变化规律。PcSad和PcHR38在前若螨、后若螨和成螨3个阶段蜕皮后8 h表达量升高,在卵末期、幼螨、前若螨和后若螨进入蜕皮8 h表达量降低,在卵末期表达量高于幼螨蜕皮后8 h的表达量。PcEcR的表达量在各次蜕皮前后均为高表达,无显著性差异。上述结果暗示这些基因参与了柑桔全爪螨生长发育过程且在不同阶段具有不同的作用。3 Ponasterone A为柑桔全爪螨蜕皮激素的活性物质3.1柑桔全爪螨蜕皮激素合成基因PcSpo对蜕皮过程的影响对柑桔全爪螨蜕皮后8 h的前若螨饲喂蜕皮激素合成基因PcSpo的dsRNA24 h后,PcSpo沉默效率达到56%,并造成柑桔全爪螨的生长发育时间延迟,蜕皮率下降,出现不能正常蜕皮并困在旧表皮中死亡的表型,累计死亡率达35%。同时,利用qRT-PCR技术检测干扰PcSpo后蜕皮激素通路相关基因的变化情况,结果显示,PcSpo被有效沉默后,与PcSpo具有相同表达模式的基因PcDib、PcSad、PcRXR2、PcE74、PcHR38和PcKR-H1的表达量均出现不同程度下调;相反,与PcSpo具有相反表达模式的基因PcShd、PcRXR1、PcE78和PcHR3的表达量均上调;PcE75的表达量也显著升高。上述结果说明PcSpo参与柑桔全爪螨的蜕皮过程。3.2 Ponasterone A对柑桔全爪螨蜕皮过程的影响在干扰PcSpo表达后,采用激素拯救的方法,鉴定柑桔全爪螨蜕皮激素的活性物质。结果显示,饲喂dsPcSpo和20E混合液36 h后,试螨的蜕皮率为26.6%,与单独饲喂dsPcSpo的蜕皮率25.7%基本一致,说明20E不能拯救dsPcSpo对柑桔全爪螨蜕皮的抑制作用;而饲喂dsPcSpo和Ponasterone A混合液36 h后,试螨的蜕皮率高达90%,说明Ponasterone A能够拯救dsPcSpo对柑桔全爪螨蜕皮的抑制作用。上述结果证实Ponasterone A是柑桔全爪螨蜕皮激素的活性物质。4柑桔全爪螨蜕皮激素合成和信号传导组织采用原位杂交技术,对柑桔全爪螨蜕皮激素合成通路基因PcSpo和信号通路基因PcRXR2在成螨体内的表达部位进行定位,结果显示,柑桔全爪螨PcSpo基因在柑桔全爪螨中枢神经块(center nervous mass)前端区域有信号,而柑桔全爪螨PcRXR2基因在柑桔全爪螨中枢神经块及其周围脂肪粒等组织均有表达。说明中枢神经块组织可能是柑桔全爪螨蜕皮激素合成和信号传导的主要组织。5柑桔全爪螨蜕皮激素受体二聚体EcR-RXR1/RXR2结合方式分析5.1干扰EcR/RXR1/RXR2对柑桔全爪螨蜕皮的影响利用RNAi技术分析蜕皮激素受体基因EcR-RXR1/RXR2对柑桔全爪螨蜕皮的影响,结果显示,对柑桔全爪螨后若螨分别饲喂dsPcEcR、dsPcRXR1和dsPcRXR2以及dsPcRXR1+dsPcRXR2 24 h后,对PcEcR、PcRXR1和PcRXR2的沉默效率分别为52.0%、69.8%和40.7%,72 h后对照组96.0%的后若螨蜕皮发育至成螨,而饲喂dsPcEcR、dsPcRXR1、dsPcRXR2和dsPcRXR1+dsPcRXR2的处理组蜕皮率分别为69.0%、46.34%、51.51%和35.0%,且均出现不能正常进入蜕皮状态而死亡的表型,死亡率分别为23.0%、48.78%、45.45%和55.0%。暗示激素受体EcR与核受体RXR1和RXR2均参与蜕皮激素信号传导过程。5.2 EcR/RXR1/RXR2在后若螨不同时间点的表达模式解析采用qRT-PCR技术解析柑桔全爪螨蜕皮激素受体基因EcR-RXR1/RXR2在后若螨不同发育时间点的表达模式,结果显示,PcEcR的表达量在后若螨蜕皮后4h到24 h持续升高,然后开始下降,在36 h达到最低;PcRXR2的表达量在4 h到12 h上升,至16 h下降后上升,到24 h时后表达量达到最高后下降,36 h达到最低;PcRXR1的表达量在后若螨蜕皮后4 h到16 h无显著性差异,然后开始升高,到28 h表达量达到最高,然后下降,到36 h表达量升高。观察柑桔全爪螨后若螨的发育情况发现,后若螨在4 h到24 h不断摄取食物,体型增大,活动能力增强,28 h时后活动能力下降,开始进入蜕皮阶段,32h后完全进入蜕皮静止状态。综合分析基因表达模式和后若螨的发育情况,发现PcEcR可能主要与PcRXR2形成异源二聚体后与蜕皮激素结合成复合体,从而诱导蜕皮激素信号通路下游基因的表达,通过一系列的应答反应调控生长发育过程,而进入蜕皮后PcEcR与PcRXR1可能形成异源二聚体调控柑桔全爪螨的蜕皮过程。5.3柑桔全爪螨后若螨不同发育时间点转录组测序分析基于柑桔全爪螨蜕皮激素受体EcR-RXR1/RXR2在后若螨不同发育时间点的结合模式,利用高通量测序技术对后若螨不同发育时间点(8 h、24 h和36 h)的样品进行转录组测序,结果显示,后若螨8 h与24 h样品相比以及24 h与36 h样品相比共有1474个差异基因。其中,后若螨8 h与24 h杨平相比有490个差异基因,包括316个上调基因和174个下调基因;在24 h与36 h样品相比中有984个差异基因,包括607个上调基因和377个下调基因。后若螨8 h、24 h与36 h样品共同差异表达上调基因为表皮蛋白和ABC转运蛋白,暗示柑桔全爪螨后若螨生长发育过程中不断合成表皮蛋白、增加表皮坚硬度,提高自身存活率。后若螨8 h与24 h样品相比特异性高表达基因包括视网膜红质基因、细胞色素b基因和ABCH-5基因,暗示PcEcR可能与PcRXR2结合调控柑桔全爪螨体色变化以及眼形成过程。而后若螨24 h与36 h样品相比特异性高表达基因包括几丁质酶基因和表皮蛋白CPAP2,暗示PcEcR与PcRXR1结合调控几丁质降解和新表皮形成。以此阐明柑桔全爪螨EcR-RXR1/RXR2在后若螨生长发育过程中不同的结合动态调控不同的生理过程。