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肌生成抑制素（Myostatin,MSTN）是Lee SJ等（1997）发现的骨骼肌生长的负调控因子，它主要在骨骼肌中表达。肌生成抑制素缺失的小鼠，骨骼肌呈现大而广范围的增长，其骨骼肌的重量是普通小鼠的2-3倍以上，而脂肪并未增加，这些结果表明肌生成抑制素作为骨骼肌生长的负调控因子参与机体的代谢。 经过30多年选育产生的双肌表型动物布鲁（Balgian Blue）牛和皮德蒙（Piedmontese）牛，头部较细，肩部、背腰部和后躯的肌肉量显著增加，肌肉与骨骼的比例增加，脂肪减少，是以肌纤维肥大和骨骼肌数量增加为特征的优良遗传表型，研究发现，其表现双肌表型的主要原因是MSTN基因发生突变。“双肌”动物的存在，引起人们的高度重视。通过对欧洲十种肉牛的MSTN cDNA序列进行分析，发现多数表现双肌表型的牛都与MSTN基因的缺失、突变有关。MSTN活性的丧失或降低，会引起动物的肌肉过度发育，肌纤维数量增加，表现为双肌症状。 本研究旨在构建猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列的真核表达载体，并在真核细胞中进行表达。从而为筛选能稳定表达MSTN的细胞株，寻找肌生成抑制素作用的受体打下良好的基础。 利用Trizol法，从军牧一号新品种猪的骨骼肌中提取总RNA。扩增出MSTN cDNA片段，与pMD18-T载体相连接，转化E.coli JM109。通过PCR、酶切鉴定及序列分析，成功地筛选到阳性克隆。 从MSTN cDNA序列中设计引物（MSTNENP1、MSTNENP2），上游5′端加BamH Ⅰ酶切位点和起始密码子ATG，下游5′端加EcoR Ⅰ和终止密码子（TTA,TCA）。以MSTN cDNA为模板，PCR扩增MSTN成熟蛋白编码序列，用1％琼脂糖电泳回收PCR产物。将PCR产物与pMD18-T载体16℃过夜连接，将连接产物转化入用CaCl2制备的感受态E.coli DH5α中，将转化菌涂布在含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基上，37℃培养12-16小时，挑选白色菌落培养，采用碱裂解法提取质粒，经 PCR和酶切鉴定，成功地构建了猪 PMDT－MSTN克隆质粒，并进行测序分析，结果与设计一致。 将克隆质粒与真核表达载体pCDNA3＊同时双酶切，用北京鼎国生物公司回收试剂盒回收猪MSTN目的片段及pCDNA3＊载体，在T4DNA连接酶的作用下将目的片段插人真核表达载体eDNA3＊的BamH和EcOR酶切位点之间，按CaC12法转化，挑选有氨个抗性(Amp习的菌落进行培养，提取质粒进行PCR和酶切鉴定，并测序分析，构建了猪MSTN成熟蛋白编码序列的真核表达质粒pCDNA3．l－MSm。 采用脂质体法转染真核细胞COS－7，将猪MSTN成熟蛋白编码序列全长358个氨基酸在COS河细胞中进行表达。提取转染细胞总RNA，采用 RT－PCR和 SDS－PAGE电泳，分别从 InRNA和蛋白水平上检测到了MSTN的表达，并用 Western blot证实了其表达的特异性。