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水牛因具有易饲养、乳质好、抗逆性强等诸多优良的生物学特性,被认为最具开发价值的经济物种之一。但我国本地水牛因发情不明显、乏情期长、产后卵巢长时间不活动等因素影响,导致繁殖性能普遍较低,致使我国水牛产业发展严重滞后。因此如何提高水牛的繁殖能力,成为推动水牛业的发展亟需解决的关键问题。研究表明BMP15和GDF9基因在雌性动物的卵泡发育过程中发挥重要作用,杂合突变的BMP15和GDF9绵羊产羔率显著高于野生型,临床医学数据也表明女性BMP15和GDF9发生突变也显著影响受孕率。为此,本研究应用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术突变BMP15和GDF9基因,探讨提高水牛繁殖性能的可行性。主要研究结果如下：1.水牛BMP15和GDF9基因的克隆及其在卵泡发育过程中的表达。通过PCR、 RT-PCR成功克隆得到水牛BMP15基因的全长CDS及全基因组序列,长度分别为1185 bp和6490 bp,序列比对显示与奶牛相应序列的相似性分别为99%和97%。水牛GDF9的全长CDS为1362bp,与奶牛序列相似性为98%。对水牛BMP15和GDF9蛋白结构通过生物信息学的预测,分析显示在氨基酸290AA-368AA (BMP15)和389AA-449AA (GDF9)位点间具有保守的TGF-β功能域。QPCR相对定量分析结果表明,胎儿期到优势化卵泡发生阶段等各时期BMP15、 BMP4、 BMP6、 Kit和C-kit基因均有表达,胎儿期卵巢Kit表达量最高,BMP15的表达量最低,BMP4和BMP6主要在腔卵泡阶段表达。2.外源性CRISPR/Cas9系统敲除活性的验证以克隆得到的水牛BMP15和GDF9 cDNA序列为模板,基于高产绵羊自然条件下BMP15和GDF9的突变位点,分别设计和构建6条gRNA序列(b-BMP15-gRNA1-6;b-GDF9-gRNA1-6),同时构建相应的gRNA活性检测报告载体(Reportor),联合Cas9表达载体共转293T细胞,通过荧光显微镜和流式细胞检测gRNA介导Cas9切割靶向切割BMP15和GDF9候选位点的活性发现,b-BMP15-gRNA2/4/5和b-GDF9-gRNA4/5具有较高的介导Cas9靶向切割目的序列的效率。为保证因转染时间过短而引发的Cas9切割目的位点活性过低或转染时间过长引发的脱靶现象,对转染不同时段的荧光强度检测发现,转染6h后,Cas9对目的靶点无显著编辑活性,12h时出现靶向编辑功能,24h后编辑显著增加,48h后,绿色荧光强度最高,72h以后无显著的提高。3.内源性CRISPR/Cas9系统基因敲除活性的验证水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibroblast, BFF)因培养和转染效率均显著难于人293T细胞系,为了检测CRISPR/Cas9内源性基因编辑效率,本研究首先以293T细胞为供体,根据NCBI发布的hBMP15、hGDF9和hCN2基因序列,设计gRNA。为增加CRISPR/Cas9系统在基因编辑的应用范围,同时选取与DNA断裂修复相关的非编码小RNA——miRNA进行编辑,实验共构建获得了6条h-BMP15-gRNA,2条h-GDF9-gRNA,3条h-mi182-gRNA,2条h-mi155-gRNA和2条h-CN2- gRNA活性载体,统计gRNA各位点个碱基分布概率发现,gRNA9-15位点A/T碱基分布较高,而第20位点G/C含量较高。以293T细胞为供体细胞,共转染miR-182和miR-155的gRNA、EGFP-N1和Cas9表达载体48h后,证明miR-182和miR-155内源性敲除效率分别为16.7%和20%,miR155-gRNA3切割效率达到100%,提示不同的基因位点基因组的编辑效率显著不同。4.水牛体细胞基因敲除的验证在上述实验的基础上,以水牛BFF细胞为供体细胞,筛选水牛BMP15和GDF9靶向突变的细胞系。根据已有文献资料,GDF9和BMP1 5同时发生杂合突变,对绵羊繁殖性能有叠加的影响。对单基因敲除发现,b-BMP 15-gRNA4/5的靶向敲除效率分别是44.4%和55.6%,b-GDF9-gRNA4/5的靶向敲除效率分别为30.8%和40%。当对水牛BMP15和GDF9进行双基因同时敲除时,载体b-BMP 15-gRNA4/b-GDF9-gRNA5的BMP15敲除效率为37.5%,GDF9为10%；b-BMP 15-gRNA5/b-G DF9-gRNA4载体的BMP15敲除效率为30%,GDF9为40%,证明在水牛BFF细胞上可以同时对两个日标基因进行编辑。为防止因移码突变而无法有效敲除目的基因,针对水牛BMP15基因序列,成功设计了2个的候选gRNA结合位点,在BFF细胞中删除约为5.4k的靶基因片段。为探讨CRISPR/Cas9系统在水牛基因组编辑中的脱靶效应,成功在水牛BMP15基因筛选了一个SNP位点,以验证gRNA脱靶效应。结果发现,当PAM模块碱基发现突变时,gRNA介导Cas9的靶向切割效率显著降低,也侧向证明了CRISPR/Cas9系统高效,定向修饰目的基因的能力和极低的脱靶现象。5.基因断裂DNA修复机制的探究CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞上可以高效、靶向的切割目的基因,但通过细胞内源性DNA修复途径(主要是同源重组和非同源末端链接)对断裂DNA位点的修复目前在技术上还很难调控,限制了针对目的基因自然突变或是外源目的基因定点整合的研究。针对细胞周期和染色体表观的改变能显著影响DNA修复途径的现象,本研究利用检测非末端同源链接报告载体研究发现,乙酰化转移酶抑制剂TSA能显著降低Reportor载体EGFP的表达,而甲基化酶抑制剂5’-AZA和蛋白酶抑制剂MG132没有显著效果,TSA分别联合5’-AZA, MG132亦不能提高Reportor载体EGFP的表达水平。500ng/ml TSA处理293T,Bcap37和水牛BFF后,通过qPCR和Western bloting分析发现,能显著提高DNA修复途径(同源链接)关键蛋白BRCA1的表达,抑制DNA修复途径(非同源末端链接)关键蛋白53BP1的表达。上述研究结果表明,CRISPR/Cas9系统能对水牛基因组进行编辑,获得高效的基因靶向修饰效率,实现细胞水平上的双基因同时编辑。