研究背景前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤,其发生发展与抑癌基因突变、DNA修复基因失活及原癌基因异常激活密切相关,有多种信号通路参与。基因的选择性剪接调控在前列腺癌中发挥重要作用,对于前列腺癌至关重要的雄激素受体(androgen receptor,AR)受剪接调控能够产生多种异构体,其中AR-V7和AR-V567es参与前列腺癌耐受内分泌治疗并进展为去势抵抗前列腺癌的过程。研究发现RNA结合蛋白KHDRBS1能够协助剪接小体识别AR外显子3b并完成剪接最终形成AR-V7,而且KHDRBS1异常促进包括前列腺癌在内的多种恶性肿瘤进展并与临床分期、病理分级和患者预后等临床指标正相关。KHDRBS1基因有两个同源且高度保守的亚家族成员,KHDRBS2和3,二者与KHDRBS1在RNA结合功能域KH域有70%～80%的氨基酸序列一致,并且与KHDRBS1存在交互作用,同时与乳腺癌、肾癌等也有关联。但KHDRBS2和3在前列腺癌中的作用研究仍属空白。本课题中我们对KHDRBS家族在PCa进展中的作用,特别是KHDRBS2和3对前列腺癌细胞的作用以及与AR及AR剪接异构体的关系进行相关探讨,以增加对KHDRBS家族的认识,丰富前列腺癌发生进展的分子机制研究。研究目的1.明确KHDRBS家族基因在前列腺癌细胞系中的表达水平;2.明确KHDRBS2和3在前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及细胞周期中的作用;3.明确KHDRBS2和3间的相互关系;4.明确KHDRBS家族与AR、AR-V7和AR-V567es的关系。研究方法和结果一、KHDRBS家族在前列腺癌中的生物信息学分析及在前列腺癌细胞系中的表达验证方法:1)应用cBioPortal在线工具对来自于TCGA等11个研究计划的前列腺癌样本集合的数据进行分析,总结KHDRBS家族基因在样本集合中基因改变的比例、表达水平以及与总生存及无病生存期的关系;2)应用Real-time PCR检测前列腺癌细胞系22RV1、LnCap、DU145和PC3细胞mRNA表达水平。结果:1)基于cBioPortal调用的11个样本集合,与KHDRBS1相比,KHDRBS2和3在PCa样本集合中的基因改变发生更为广泛,并且KHDRBS3能够影响样本集合中患者的总生存,提示KHDRBS2和3可能与PCa发生发展相关。2)样本均为去势抵抗性前列腺癌及去势抵抗性神经内分泌前列腺癌的NEPC样本集合中,KHDRBS1,2和3基因发生改变的样本比例最高,提示KHDRBS家族可能与去势抵抗性前列腺癌进展有关。3)K KHDRBS1在22RV1、LnCap、DU145和PC3中均有表达。22RV1细胞中KHDRBS2高表达,KHDRBS3低表达;而PC3细胞中KHDRBS2低表达,KHDRBS3高表达。提示二者的表达具有细胞类型特异性。二、KHDRBS2和3对前列腺癌细胞的作用方法:1)应用瞬时转染过表达及慢病毒转染敲减改变KHDRBS2和3在22RV1和PC3细胞中的表达水平,并应用Muse细胞仪、Transwell法及CCK-8法和体内成瘤实验分别检测细胞的细胞周期、迁移、侵袭及体外和体内的增殖能力。2)同前法改变KHDRBS2和3在22RV1和PC3细胞中的表达水平,应用Real-time PCR及Western-Blot检测对应细胞中KHDRBS2和3的变化,明确KHDRBS2和3在前列腺癌细胞中的关系。结果:1)瞬时过表达能够成功构建高表达KHDRBS2和3的PC3和22RV1细胞模型;2)慢病毒转染敲减KHDRBS2或3能够成功构建低表达KHDRBS2的22RV1或低表达KHDRBS3的PC3细胞模型;3)敲减KHDRBS2能够抑制22RV1细胞的增殖能力,而敲减KHDRBS3能够抑制PC3细胞的增殖能力;4)过表达或敲减KHDRBS2后KHDRBS3在mRNA和蛋白水平的表达发生降低或增高改变,而过表达或敲减KHDRBS3之后KHDRBS2的表达水平也发生降低或增高,但改变KHDRBS2或3的表达对KHDRBS 1的表达水平则无影响。三、KHDRBS家族与雄激素受体的关系方法:1)应用 Real-time PCR 检测 22RV1、LnCap、DU145 和 PC3 细胞 AR-FL、AR-V7和AR-V567es的表达水平。2)应用Real-time PCR检测有无雄激素及AR拮抗剂的条件下,22RV1细胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es及22RV1和PC3细胞中KHDRBS1,2和3的表达水平。3)应用Real-time PCR检测过表达KHDRBS2和3及敲减KHDRBS2的22RV1细胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es的表达水平。4)在有无雄激素的条件下,应用Real-time PCR检测过表达KHDRBS2和3的22RV1细胞中KHDRBS2和3的mRNA表达变化以及敲减KHDRBS2的22RV1细胞中KHDRBS2、KHDRBS3、AR 和 AR-V7 的 mRNA 表达变化。结果:1)22RV1细胞中AR-FL、AR-V7和AR-V567es高表达;而在PC3细胞中三种AR异构体均低表达。2)无雄激素条件下22RV1细胞中AR、AR-V7和AR-V567es及KHDRBS1和2表达水平较正常培养组显著升高,具有统计学意义,KHDRBS3虽有升高趋势,但无统计学意义;在PC3中,同样处理对于KHDRBS家族基因的表达无影响;3)敲减KHDRBS2可显著降低22RV1细胞中AR-V7的表达水平,P值为0.0168。4)过表达KHDRBS2和3以及敲减KHDRBS2的22RV1细胞,无论是否添加雄激素,KHDRBS2、KHDRBS3、AR和AR-V7的mRNA表达变化与未做过表达和敲减的22RV1细胞对雄激素的反应一致。研究结论1.cBioPortal分析前列腺癌样本提示KHDRBS2和3可能在前列腺癌及去势抵抗性前列腺癌发生进展中具有重要作用。2.在22RV1和PC3细胞,KHDRBS2和3的表达具有细胞类型特异性并与AR及其异构体表达表现出相关性。3.分别敲减KHDRBS2或3能够抑制22RV1或PC3细胞的增殖能力。4.在22RV1和PC3细胞中,KHDRBS2和3呈现交互调节的关系。5.去除雄激素导致的KHDRBS1和2表达上调可能是由AR-FL介导的。敲减KHDRBS2可以抑制22RV1细胞AR-V7的表达。KHDRBS1和2可能是AR-FL与AR-V7之间的调控因素。