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【摘 要】本文对无菌检查试验的存在的问题进行介绍并提出应对策略。
【关键词】无菌检查；试验；策略
无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法[1-2]。无菌 （asepsis） 物体中无活的微生物存在，称为无菌。我国开展药品无菌检查和微生物限度检查已有数十年的历史。新中国第一部药典（1953年版）收载了无菌检查法，以后每部进行了不断的修订和完善，从样品的取样量到培养时间的变化都更加的科学，合理[3-4]。本文对无菌检查试验的存在的问题进行介绍并提出应对策略。
1.无菌检查试验的先天缺陷
1.1采样
由于没有从统计学的角度考虑采样，使无菌检查试验检测污染物的能力受到限制，出现错误结果的可能性很大。有学者从统计学角度分析发现污染率越低对污染物漏检的可能性越大。由于不可能对一批成品的每一包装单位进行检测，所以药品生产者必须遵守GMP进行生产。无菌生产工艺的验证、良好厂房设计、员工的培训，才能取得高水平的无菌保障[5]。
1.2培养条件
研究表明，药典规定的微生物培养条件并不是许多细菌和真菌的最适生长条件[6]。细菌生长在二十五摄氏度到四十摄氏度之间，真菌生长在二十五摄氏度到三十摄氏度之间，而药典规定在二十摄氏度到二十五摄氏度下培养。 药典对温度规定的目的是检测环境中的污染菌。美国药典无菌试验专家委员会推荐25～30℃为细菌、酵母菌和霉菌的培养温度[6]。用不同的培养基检查不同的细菌、酵母菌和霉菌，结果发现， 二十六摄氏度培养真菌和酵母菌10天后，胰酪胨大豆胨肉汤培养基的效率不及蛋白胨肝消化肉汤等培养基[6]。硫乙醇酸盐流体培养基也不适用于苛求厌氧菌的恢复培养[7]。胰酪胨大豆胨肉汤培养基不适用于对苛求微生物的培养。
2.西方国家相应的对策
2.1美国
2012年修订的美國联邦法规21CFR610.12，规定了一个不同于药典描述的无菌检查方法。FDA修订该法规的目的是为了确保生物制品的安全性。21CFR61O.12取消了微生物、培养时间、培养温度、培养基、取样量和采样计划等内容并允许使用非培养的检测方法。
2.2欧洲
欧洲药典的非强制章节“5.1.9无菌试验使用指南”指出，无菌试验合格结果的保证水平取决于批次的均一性、生产条件、采样方法等的有效性；对于最终灭菌产品提供灭菌过程的证据比无菌试验更重要。2007年新载入欧洲药典的“细胞产品的微生物控制”中指的方法可代替无菌检查。
2.3澳大利亚
在2006年发布的《治疗产品无菌检查指南》中提出了控制无菌检查试验的附加试验一停滞试验。停滞试验目的是要证明使用的培养基在整个培养期是否具有支持生长的能力。《治疗产品无菌检查指南》的原理部分指出：统计学考虑也是无菌检验成功的重要一环；药典无没有对所使用的培养基作具体要求，只是从原则上菌检查方法不利于对低水平污染的检出。
3.对规范我国药品标准中无菌检查试验的思考
3.1应对无菌检查试验做出充分的解释
我国少数药品生产企业的部分从业人员对药品无菌检查试验的原理理解不深，导致无菌检查试验方法不规范。药品监督管理部门对生产企业加强监管的同时，应制订与欧洲药典“无菌试验使用指南”相类似的文件，促进我国药品质量的提高。我国药典没有对无菌检查试验的原理、所起作用等做详细的解释说明。这样导致了部分企业重无菌检查结果，轻质量管理。我国药典或相关法规应以适当方式提示至少注意以下几点：对于最终灭菌的产品提供灭菌过程的证据比无菌检查试验更重要；没有绝对的无菌保证，通过验证很重要；即使整个批次均一，能检测出低水平污染的可能性也是非常小的。
3.2无菌检查方法的制订要考虑生物制品的特殊性
美国、欧洲、澳大利亚的药典或其它法规中，对生物制品的无菌检查方法都另有专门的规定[8-10]。生物制品因为其原料、生产过程、内含成份、具有生物活性等特点，使用单一的无菌检查方法会存在风险[11]。我国也应对生物制品的无菌检查做专门规定，特别在使用培养基和相应培养条件等方面。
3.3抽样方案
国药典规定了不同药物产品的原液、半成品、成品最少抽验数量，没有对抽样方式做具体规定。我国应参考欧洲、美国、澳大利亚的相关规定并结合自身特点，增加对抽样方式的规定。
3.4对培养基的规定
中国药典无菌检查法规定使用2个培养基：硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，用两个培养基完全覆盖所有需要无菌检查的药品并不现实。欧洲药典“细胞产品微生物控制”没有指定培养基，但规定了更严格的培养基促生长性能检查法和基于实践中最可能污染微生物的方法验证。中国应对于某些特殊药品应允许使用经验证的替代培养基。
3.5微生物检验的新技术
应用微生物检验的新技术如生物发光技术、电化学技术、比浊法、固相细胞计数法、流式细胞计数法、脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。微生物检验的新技术与传统的检验方法比较，具有检验简便，速度快的特点，有实时或近实时监控的潜力，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价，因此在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法。采用非药典规定的替代方法进行微生物检验时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。 [科]
【参考文献】
[1]陈秀勤，刘炳茹，乙静平.常见抗生素的无菌检查法最佳冲洗条件的考察[J].中国药品标准，2004（04）.
[2]罗书香.药品微生物限度检查方法验证资料分析[J].中国药事，2007（07）.
[3]许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005（04）. [4]李汶.局部給药制剂的控制菌检查方法概况[J].中国药品标准，2007（03）.
[5]Cundell AM.Microbial Testing inSupportof Aseptic Processing[J].Pharmaceutical Technology，2004，1：56-66.
[6]McGuire J and Kupiec TC.Quality Control Analytical Meth—ods：The Quality of Sterility Testing[J].International Journal of Pharmaceutical Compounding，2007，11 （1）：52-55.
[7]BD：Instructions for use ready—to—usebottled media，BD Tryptic Soy Broth （TSB）[BE/OL].[2008 02～01].ht—tp：//www.bd.corn/leaving/europe/regulatory/As—sets/IFU/HB/CE/BA/BA一257107.Pdf.
[8]European Pharm acopoeia 7.0。Volume 1. 2.6.27 M icrobio logical Control of Cellular Products Is].2011：19-192.
[9]Code of Federal Regulations，21CFR610.1 2 Sterility [BE/OL].[2012—04 01].http：//www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/cfrsearch.
[10]Australian Government，Departm ent of Health and Ageing，Therapeutic Goods Administration （TGA）.TGA Guide—lines for Sterility Testing of Therapeutic Goods[BE/（）I ].[2014—2—20]http：//www.tga.gov.au/docs/html/sterilit.htm.
[11]Richard MJ，Sabatini C，Ardiot S，et a1.Ten Years of External Quality Control for Cellular Therapy Products in France.In： Progress in M olecular and EnvironmentalBioengineering—-—-FromAnalysisandModelingtoTechnologyApplica
tions[M].Carpi A.（ed）：InTech，2011：83-114.
【关键词】无菌检查；试验；策略
无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法[1-2]。无菌 （asepsis） 物体中无活的微生物存在，称为无菌。我国开展药品无菌检查和微生物限度检查已有数十年的历史。新中国第一部药典（1953年版）收载了无菌检查法，以后每部进行了不断的修订和完善，从样品的取样量到培养时间的变化都更加的科学，合理[3-4]。本文对无菌检查试验的存在的问题进行介绍并提出应对策略。
1.无菌检查试验的先天缺陷
1.1采样
由于没有从统计学的角度考虑采样，使无菌检查试验检测污染物的能力受到限制，出现错误结果的可能性很大。有学者从统计学角度分析发现污染率越低对污染物漏检的可能性越大。由于不可能对一批成品的每一包装单位进行检测，所以药品生产者必须遵守GMP进行生产。无菌生产工艺的验证、良好厂房设计、员工的培训，才能取得高水平的无菌保障[5]。
1.2培养条件
研究表明，药典规定的微生物培养条件并不是许多细菌和真菌的最适生长条件[6]。细菌生长在二十五摄氏度到四十摄氏度之间，真菌生长在二十五摄氏度到三十摄氏度之间，而药典规定在二十摄氏度到二十五摄氏度下培养。 药典对温度规定的目的是检测环境中的污染菌。美国药典无菌试验专家委员会推荐25～30℃为细菌、酵母菌和霉菌的培养温度[6]。用不同的培养基检查不同的细菌、酵母菌和霉菌，结果发现， 二十六摄氏度培养真菌和酵母菌10天后，胰酪胨大豆胨肉汤培养基的效率不及蛋白胨肝消化肉汤等培养基[6]。硫乙醇酸盐流体培养基也不适用于苛求厌氧菌的恢复培养[7]。胰酪胨大豆胨肉汤培养基不适用于对苛求微生物的培养。
2.西方国家相应的对策
2.1美国
2012年修订的美國联邦法规21CFR610.12，规定了一个不同于药典描述的无菌检查方法。FDA修订该法规的目的是为了确保生物制品的安全性。21CFR61O.12取消了微生物、培养时间、培养温度、培养基、取样量和采样计划等内容并允许使用非培养的检测方法。
2.2欧洲
欧洲药典的非强制章节“5.1.9无菌试验使用指南”指出，无菌试验合格结果的保证水平取决于批次的均一性、生产条件、采样方法等的有效性；对于最终灭菌产品提供灭菌过程的证据比无菌试验更重要。2007年新载入欧洲药典的“细胞产品的微生物控制”中指的方法可代替无菌检查。
2.3澳大利亚
在2006年发布的《治疗产品无菌检查指南》中提出了控制无菌检查试验的附加试验一停滞试验。停滞试验目的是要证明使用的培养基在整个培养期是否具有支持生长的能力。《治疗产品无菌检查指南》的原理部分指出：统计学考虑也是无菌检验成功的重要一环；药典无没有对所使用的培养基作具体要求，只是从原则上菌检查方法不利于对低水平污染的检出。
3.对规范我国药品标准中无菌检查试验的思考
3.1应对无菌检查试验做出充分的解释
我国少数药品生产企业的部分从业人员对药品无菌检查试验的原理理解不深，导致无菌检查试验方法不规范。药品监督管理部门对生产企业加强监管的同时，应制订与欧洲药典“无菌试验使用指南”相类似的文件，促进我国药品质量的提高。我国药典没有对无菌检查试验的原理、所起作用等做详细的解释说明。这样导致了部分企业重无菌检查结果，轻质量管理。我国药典或相关法规应以适当方式提示至少注意以下几点：对于最终灭菌的产品提供灭菌过程的证据比无菌检查试验更重要；没有绝对的无菌保证，通过验证很重要；即使整个批次均一，能检测出低水平污染的可能性也是非常小的。
3.2无菌检查方法的制订要考虑生物制品的特殊性
美国、欧洲、澳大利亚的药典或其它法规中，对生物制品的无菌检查方法都另有专门的规定[8-10]。生物制品因为其原料、生产过程、内含成份、具有生物活性等特点，使用单一的无菌检查方法会存在风险[11]。我国也应对生物制品的无菌检查做专门规定，特别在使用培养基和相应培养条件等方面。
3.3抽样方案
国药典规定了不同药物产品的原液、半成品、成品最少抽验数量，没有对抽样方式做具体规定。我国应参考欧洲、美国、澳大利亚的相关规定并结合自身特点，增加对抽样方式的规定。
3.4对培养基的规定
中国药典无菌检查法规定使用2个培养基：硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，用两个培养基完全覆盖所有需要无菌检查的药品并不现实。欧洲药典“细胞产品微生物控制”没有指定培养基，但规定了更严格的培养基促生长性能检查法和基于实践中最可能污染微生物的方法验证。中国应对于某些特殊药品应允许使用经验证的替代培养基。
3.5微生物检验的新技术
应用微生物检验的新技术如生物发光技术、电化学技术、比浊法、固相细胞计数法、流式细胞计数法、脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。微生物检验的新技术与传统的检验方法比较，具有检验简便，速度快的特点，有实时或近实时监控的潜力，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价，因此在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法。采用非药典规定的替代方法进行微生物检验时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。 [科]
【参考文献】
[1]陈秀勤，刘炳茹，乙静平.常见抗生素的无菌检查法最佳冲洗条件的考察[J].中国药品标准，2004（04）.
[2]罗书香.药品微生物限度检查方法验证资料分析[J].中国药事，2007（07）.
[3]许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005（04）. [4]李汶.局部給药制剂的控制菌检查方法概况[J].中国药品标准，2007（03）.
[5]Cundell AM.Microbial Testing inSupportof Aseptic Processing[J].Pharmaceutical Technology，2004，1：56-66.
[6]McGuire J and Kupiec TC.Quality Control Analytical Meth—ods：The Quality of Sterility Testing[J].International Journal of Pharmaceutical Compounding，2007，11 （1）：52-55.
[7]BD：Instructions for use ready—to—usebottled media，BD Tryptic Soy Broth （TSB）[BE/OL].[2008 02～01].ht—tp：//www.bd.corn/leaving/europe/regulatory/As—sets/IFU/HB/CE/BA/BA一257107.Pdf.
[8]European Pharm acopoeia 7.0。Volume 1. 2.6.27 M icrobio logical Control of Cellular Products Is].2011：19-192.
[9]Code of Federal Regulations，21CFR610.1 2 Sterility [BE/OL].[2012—04 01].http：//www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/cfrsearch.
[10]Australian Government，Departm ent of Health and Ageing，Therapeutic Goods Administration （TGA）.TGA Guide—lines for Sterility Testing of Therapeutic Goods[BE/（）I ].[2014—2—20]http：//www.tga.gov.au/docs/html/sterilit.htm.
[11]Richard MJ，Sabatini C，Ardiot S，et a1.Ten Years of External Quality Control for Cellular Therapy Products in France.In： Progress in M olecular and EnvironmentalBioengineering—-—-FromAnalysisandModelingtoTechnologyApplica
tions[M].Carpi A.（ed）：InTech，2011：83-114.