利用RNA干扰 (RNAi) 技术沉默宫颈癌细胞系HeLa细胞中乙酰肝素酶 (HPA) 基因的表达,并探讨其对宫颈癌细胞侵袭力的影响。

根据GenBank数据库提供的HPA基因核苷酸序列,设计4对针对HPA基因的短发夹状RNA (shRNA) 特异性寡核苷酸序列 (即sh RNA-HPA-592、sh RNA-HPA-995、shRNA-HPA-1351、sh RNA-HPA-1658),并设计1条随机无关序列作阴性对照,分别克隆到p Yr-1.1质粒中。用脂质体法将上述质粒转染入HeLa细胞,以未转染质粒者为空白对照,采用逆转录 (RT) -PCR技术、免疫荧光法分别检测转染后HeLa细胞中HPA mRNA和蛋白的表达,筛选出其中对HPA基因沉默效果最佳的质粒。将该质粒转染入HeLa细胞,采用穿膜 (transwell) 小室体外侵袭实验检测转染后HeLa细胞侵袭力的变化。

RT-PCR技术检测显示,转染shRNA-HPA-592、sh RNA-HPA-995、sh RNA-HPA-1351、shRNA-HPA-1658质粒后,HeLa细胞中HPA mRNA的表达水平分别为0.54±0.05、0.89±0.18、0.82±0.22、0.91±0.47,阴性对照和空白对照细胞中HPA mRNA的表达水平分别为1.31±0.72和1.09±0.16;免疫荧光法检测显示,转染上述不同质粒后HeLa细胞的胞质中均可见绿色荧光,HPA蛋白均呈阳性表达,其中转染shRNA-HPA-592质粒后HeLa细胞的胞质中绿色荧光强度最弱。故筛选出的对HPA基因沉默效果最佳的质粒即为sh RNA-HPA-592质粒。体外侵袭实验检测显示,转染sh RNA-HPA-592质粒后HeLa细胞的穿膜细胞数为 (44±4) 个,明显低于空白对照、阴性对照[分别为 (182±6) 、 (258±17) 个],差异有统计学意义 (P<0.01) ;而阴性对照与空白对照比较,差异无统计学意义 (P>0.05) 。

本研究成功筛选出了靶向HPA基因的shRNA表达质粒,转染宫颈癌HeLa细胞后可高效抑制其HPA基因的表达,明显降低宫颈癌细胞的侵袭力,为进一步研究HPA基因的表达与宫颈癌侵袭的机制奠定了基础。