核黄素又名维生素B2,是一种异咯嗪衍生物。这种黄色晶体最早从乳清当中分离,因其分子结构中含有核糖醇基而被命名为核黄素。核黄素属于B族维生素家族,其在哺乳动物生长发育过程中起着重要的作用。因而核黄素在饲料行业、食品医药行业中都着有广泛的应用。微生物发酵法是现在最主要的核黄素生产方法。高产菌株的获取从初期的诱变筛选和简单代谢工程改造,发展到结合系统生物学与基因组、转录组、代谢组学等方法进行全面解析。历经近70年的发展,工业菌株的产量与转化率均不断提高,逐步替代了传统的化学合成法和化学半合成法,成为了微生物发酵法替代化学合成法生产复杂有机分子的典型范例。虽然理性改造的技术手段不断丰富,但是以诱变筛选为首的非理性改造在突破代谢瓶颈与寻找新的突变位点等方面仍具有不可替代的作用。此外,随着流式细胞仪、液滴微流控、自动化育种筛选等高通量设备的应用,筛选的效率也大幅提升。和其他大多数代谢产物不同,核黄素作为一种天然的黄绿色荧光物质具有和绿色荧光蛋白类似的发射光,这种得天独厚的条件为以荧光筛选高产菌株提供了方便。然而利用高通量筛选技术进行核黄素高产菌株筛选的工作直到最近才有所报道。Chen等人利用液滴微流控对一株产核黄素的乳酸菌的随机突变库进行筛选,菌株的核黄素产量从1.51mg/L提升到2.81 mg/L。Wagner等人在对解脂耶氏酵母进行诱变-筛选研究中则发现使用流式细胞筛选得到的高产菌其胞内核黄素产量较高,而使用液滴微流控筛选到的菌株其胞外核黄素产量较高。然而两篇文章中所用出发菌株的核黄素产量都比较低,对于产量较高的菌株尚未建立合适的高通量筛选方法。因此本文探究了流式细胞分选,液滴微流控分选,微孔板分选等方法在核黄素高产菌株筛选中的适用性。我们首先使用不同产量的两株核黄素高产枯草芽孢杆菌S0和S1评价流式细胞筛选和液滴微流控筛选对二者的分辨能力。摇瓶发酵实验中S0的产量为2.58±0.09 g/L,S1的产量为2.12±0.05 g/L,然而通过流式细胞仪难以区分两株菌的荧光差异,而通过液滴微流控包埋发酵液上清则能明显区分SO和S1(其荧光信号分别为1.4和1.2)。随后我们尝试使用液滴微流控对高产菌进行分选。S0和S1经过单细胞包埋和静置培养后液滴荧光具有差异,但经过分选后其成活率却极低(2±1个细胞/2000个液滴)。为了探索造成活率低较原因,我们尝试改变分选电压、培养时间、培养基成分等条件,但均没有收到很好的效果。然而我们发现另一株不同来源的高产菌株R1却具有较高的分选成活率(22±3个细胞/1000个液滴)。这说明在液滴分选中核黄素高产菌株的存活率具有菌株差异性。此外为了探索更为简便有效的核黄素高产菌株筛选方法,我们尝试了96孔板震荡培养和96孔板静置培养两种方式。我们发现当以荧光作为检测方法时,静置培养42小时S0的荧光为18951±585 a.u.,S1为13969±850 a.u.;震荡培养18小时S0的荧光为28707±649 a.u.,S1为22150±1486a.u.。两种方法均可对高低产菌株进行区分。然而针对不同需求两种方法各有其优势:静置培养相对于震荡培养对设备要求更低,并且节约空间,而震荡培养更节省时间。