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背景铅广泛的分布于自然界中,是地壳中发现含量最为丰富的重金属元素之一。自然界中的铅以多种形式存在,如金属铅、铅的氧化物,铅的一些化合物在工业生产及日常生活中也较为常见。铅被广泛的应用于工业、农业,日常生活用品如化妆品等。铅主要以铅烟、粉尘、蒸汽的形式存在于空气中。铅主要通过呼吸道和消化道进入人体。铅在人体内的半衰期很长,所以低浓度的铅即可导致人体产生持续、慢性的危害。近年来,随着现代工业的发展,铅的开采和冶炼、熔铅作业等增多,铅污染日益严重,影响周围环境和人们的健康,铅污染已经成为了全球公共卫生问题。铅对人体的危害非常大。铅可以模拟钙离子进入人体的途径。铅对人体多种器官都能造成严重危害：造血系统、神经系统、心血管系统、免疫系统、生殖系统以及肝和肾等。细胞凋亡是指机体为了维持内环境的稳定,由基因控制的细胞程序性死亡,它在生物进化、生长以及多个系统发育中起着重要作用。细胞凋亡做为生命现象之一,是目前研究的热点。有大量文献报道,金属元素可以诱导细胞凋亡,因此细胞凋亡可能成为金属元素导致细胞毒性的机制之一。铅在体内主要以二价离子形式存在。铅可以模拟Ca2+或者其他金属离子如Fe2+、Zn2+。细胞质中几种非常重要的蛋白分子也可能是铅的靶目标如蛋白激酶C、突触结合蛋白、钙调蛋白、6-氨基-γ-酮戊酸脱水酶(ALAD)、血红素合成酶等。铅可以与具有二价金属离子的酶竞争性的结合酶分子,使酶失去正常催化功能,引起神经毒性,严重可以导致中毒性脑病和周围神经病；铅还可干扰血红细胞和肾脏细胞的离子交换能力,引起贫血以及肾脏相关疾病。既然铅可以通过模仿以上二价阳离子,与蛋白质竞争性结合从而干扰细胞内正常活动,那么质膜上的参与此类阳离子转运的离子通道,转运蛋白等可能都会与铅进入细胞内的机制有关。钙池操纵钙进入(Store-Operated Calcium Entry, SOCE)是一个在非兴奋细胞中钙离子进入细胞内的方式,是指当细胞内钙库钙离子释放时激活质膜上的钙离子通道,使外钙进入细胞内来重新充盈胞内的钙库。SOCE也存在于神经细胞以及肌肉细胞中,它对诸如基因表达、细胞增殖、迁移、细胞激活、血小板凝集等许多生理功能都具有重要的调控作用。组成SOCE有几个非常重要的结构蛋白：存在于内质网膜上的基质相互作用的蛋白1(Stromal interacting molecule, STIM1)、存在于质膜上蛋白(Orail)、瞬时受体蛋白家族(Transient receptor potential, TRPs)。STIM1是一个含有多个功能区域的钙离子结合蛋白,它被认为是内质网钙离子的感受器。STIM1是一个多结构域蛋白,其位于内质网(Endoplasmic reticulum,3R)腔内的N末端具有EF-hand和SAM(Sterile alpah-motif, SAM)结构域,C末端有ERM(Ezrin-radixni-moesin homology region,ERM)结构域、丝氨酸/脯氨酸富集的结构域和Lys富集的结构域构成。EF手可以结合钙离子,使STIM1以非聚集形式与质膜之间保持距离；当ER的钙离子缺失的时候,EF手会释放钙离子,STIM1会寡聚化,STIM1会聚集到内质网距离质膜10-25nnm的区域。Orail可以调控钙离子释放激活钙离子电流(Calcium release-activated Calcium current, CRAC)。有研究表明当细胞内的钙库缺失的时候,STIM1和Orail会重新分布到ER-PM区域。当钙库缺失的时候,Orail只有在STIM1存在的时候才能分布到ER-PM区域。STIM1在胞质中的几个部分包括多碱的C端、富含丝氨酸-脯氨酸的区域,已经被指出可以激活Orai1通道。STIM1的一段螺旋卷曲区域[STIM1(383-389)]包含一段高度保守的区域SOAR(STIM1Orai activating region, SOAR)[STM1(334-442)](稍微长一点的区域被称为CRAC activation domain, CAD)。CAD可以完全激活Orai1的C端。TRPC1在哺乳动物中是第一个被鉴定的TRP家族蛋白,在很多细胞或者组织中均存在。TRPC1已经被鉴定为是SOCE重要的成分。STIM1的ERM结构域与TRPC通道结合,诱导其异源多聚化。STIM1门控TRPC1可以通过静电相互作用来实现。TRPC1带负电的天冬氨酸(639DD640)可以和STIM1带正电的赖氨酸(684KK685)相互作用。从上面的介绍我们可以看出STIM1可以通过不同的机制来活化Orai1和TRPC1。钙池操纵的钙通道(store-operated calcium channels,SOCs)广泛的存在于非兴奋性细胞膜上,是胞外钙离子进入细胞内的重要通道,且构成SOCs的结构蛋白S TIM1、Orai1、TRPC1之间存在着相互调控作用。本实验主要探讨Pb2+是否通过SOCE进入细胞内,它的具体分子调控机制以及对细胞毒性作用的分子机制。目的明确STIM1是否参与铅进入细胞；探讨STIM1经由活化Orai1和TRPC1而参与铅进入细胞；探讨STIM1是否参与铅的细胞毒性作用以及具体的分子机制。方法1.将人胚胎肾细胞HEK293细胞置于5%C02,95%的空气,37℃培养箱中培养。过表达STIM1-WT以及下调STIM1,100μM铅处理24h,ICP-MS检测铅进入细胞的情况。2.在HEK293细胞中过表达STIM1-CAD和STIM1-deleteCAD之后,100μM的铅处理24h,ICP-MS检测铅进入细胞的情况。3.在HEK293细胞中过表达TRPC1以及下调TRPC1,100μM的铅处理24h,ICP-MS检测铅进入细胞的情况。4.将STIM1下调以及过表达质粒STIM1-deleteCAD、STIM1DD后,100μM的铅处理24h,ICP-MS检测铅进入细胞的情况。5.分别转染STIM1DD、TRC1KK以及共转染STIMIDD+TRPCIKK,100μM的铅处理24h, ICP-MS检测铅进入细胞的情况.6.siRNA干扰下调STIM1,100μM的铅处理24h,流式细胞仪检测细胞的凋亡。7.分别过表达STIM1DD或STIM1-deleteCAD,100μM的铅处理24h,流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果1.STIMl参与铅进入细胞在HEK293细胞中过表达STIM1以及采用siRNA干扰下调STIM1,100μM的铅处理24h,ICP-MS检测铅进入细胞的情况。结果显示过表达STIM1-WT以及下调STIM1,可以分别增加或减少铅离子进入细胞,说明STIM1参与铅进入细胞。2.STIM1-CAD活化Orail参与铅进入细胞在HEK293细胞中过表达STIM1-CAD和STIM1-deleteCAD之后,100μM的铅处理24h,ICP-MS检测铅进入细胞的情况。结果显示过表达STIM1-CAD铅的进入量显著高于过表达STIM1-deleteCAD.表明STIM1-CAD活化Orai1参与铅进入细胞。3.TRPC1参与铅进入细胞在HEK293细胞中过表达TRPC1以及下调TRPC1,100μM的铅处理24h,ICP-MS检测铅进入细胞的情况。结果显示过表达TRPC1-WT或采用siRNA干扰下调TRPC1,可以分别增加和减少铅离子进入细胞。说明TRPC1参与铅进入细胞。4.STIM1活化Orail或TRPC1参与铅内流在HEK293细胞中将STIM1下调以及过表达质粒STIM1-deleteCAD、 STIM1DD后,100μM的铅处理24h,ICP-MS检测铅进入细胞的情况。结果显示STIM1下调后铅的进入量最低,STIM1下调STIM1活化Orai1或TRPC1的作用降低；过表达STIM1-deleteCAD铅的进入低于过表达STIM1DD, STIM1-deleteCAD无法活化Orai1, STIM1DD无法活化TRPC1。说明STIM1通过活化Orai1参与铅进入细胞的作用较之于其活化TRPC1更为重要。5.STIM1通过静电相互作用活化TRPC1参与铅进入细胞在HEK293细胞中过表达STIM1DD、TRC1KK以及共转染STIM1DD+TRPC1KK,100μM的铅处理24h,ICP-MS检测铅进入细胞的情况。结果显示突变的]RPC1KK失去了TRPC1的正常功能,铅进入量明显降低。共转染STIMIDD+TRPCIKK铅的进入量显著高于单独转染TRPC1KK组,STIM1DD组。说明共转染了突变的STIM1DD和突变的]RPC1KK,重现了STIM1与TRPC1之间的静电相互作用,从而恢复了铅离子内流。6.STIM1参与铅的细胞毒性作用在HEK293细胞中用siRNA干扰的方法下调STIM1, l00μM的铅处理24h,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果显示STIM1下调后,细胞的凋亡率增加,铅进入细胞导致细胞凋亡率变化的趋势与下调STIM1后铅进入细胞的趋势相同。结果说明STIM1参与铅的细胞毒性。7.STIM1通过活化Orail和TRPC1参与铅的细胞毒性作用在HEK293细胞中过表达STIM1DD和STIM1-deleteCAD,100μM的铅处理24h,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果显示过表达STIM1DD、 STIM1-deleteCAD之后铅进入细胞内所导致凋亡率下降。说明STIM1通过不同的分子机制活化Orai1和TRPC1参与铅的细胞毒性作用。结论本实验的研究结果显示,铅可以通过SOCE通道进入细胞内,SOCE的重要的分子STIM1参与铅进入细胞,STIM1通过不同的机制活化Orail和TRPC1参与铅进入细胞以及铅的细胞毒性作用。