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矮牵牛PhWRIL1(Petunia hybrida WRINKLED Like 1)基因属于AP2/ERF(APETALA2/ETHYLENE-RESPONSIVE ELEMENT-BINDING FACTOR)家族ANT(AINTEGUMENTA)组的basalANT亚组。AP2基因家族可分为euAP2和ANT组,其中ANT含有10-aa和1-aa这两段插入,而euAP2缺失这两段插入。ANT组又可以进一步分为euANT和basalANT亚组,euANT亚组在N端的R1结构域上游有3个保守基序(euANT2,3和4基序),而basalANT亚组没有这3个基序,并且euANT亚组的R1结构域上游序列的长度比basal ANT亚组的长。AP2基因家族的euAP2组基因主要调控植物花发育过程花分生组织的特性和花器官的分化。euANT亚组基因主要参与调控细胞增殖和器官生长,花器官发育,促进体细胞胚胎发生和异位器官形成等过程。basalANT组与eu ANT亚组亲缘关系很近,现在已知的主要功能是调控油脂生物合成,但尚未有关于与euANT支亲缘关系很近的AP2/ERF基因basalANT进化支基因超量表达对离体培养中不定芽再生影响的研究。研究矮牵牛basalANT组的PhWRIL1基因的功能特别是在离体再生方面的功能不仅有助于认识basalANT亚组基因在矮牵牛的植物生长发育中的作用,同时对利用基因工程手段对矮牵牛的性状进行改造、提高矮牵牛的观赏性具有重要意义。本实验通过构建矮牵牛basalANT组的PhWRIL1基因的超表达以及定点敲除的表达载体,并对T1代转基因植株和E1(Genome Editing 1)代突变体的表型以及离体培养结果进行观察分析来研究矮牵牛basalANT组PhWRIL1基因的功能。取得了以下研究成果:1.矮牵牛PhWRIL1(WRINKLED Like 1)基因的克隆和序列分析以矮牵牛自交系‘Mitchell Diploid’(MD)为材料,通过EST(expressed sequence tagged)数据库搜索和RACE技术从矮牵牛中克隆了一个AP2/ERF家族基因PhWRIL1,进行测序得到其cDNA序列。PhWRIL1基因的CDS(Coding Sequence)长945 bp,编码314个氨基酸的蛋白质,编码框两端有161 bp的3’-UTR(3’-untranslated region)和196 bp的5’-UTR(5’-untranslated region)。序列分析和进化树分析表明,PhWRIL1属于basalANT类基因。2.矮牵牛PhWRIL1基因组织特异性分析实时荧光定量PCR分析表明PhWRIL1 mRNA在矮牵牛多种器官中累积,其中在矮牵牛根、茎、花蕾中的PhWRIL1比茎尖、叶中的表达量更高。3.PhWRIL1超量表达载体转化矮牵牛的T1代转基因植株的表型观察超量表达PhWRIL1的矮牵牛转基因植株呈现明显的矮化表型,植株生长发育不良,叶和花明显比对照小,但开花时间并未因外源基因的表达而明显延迟。用2.5μmol/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)对T1代PhWRIL1超量表达转基因株系矮牵牛进行离体培养,PhWRIL1超量表达转基因植株叶片外植体再生不定芽的能力受到强烈的抑制。4.PhWRIL1定点敲除载体转化矮牵牛和E1代突变体表型观察在PhWRIL1基因5’端靠近翻译起始位点的区域选择一个靶点,构建敲除PhWRIL1的植物表达载体,农杆菌介导法转化矮牵牛,经过Basta筛选并通过PCR检测分别获得了单碱基突变和片段缺失的突变体株系,然后得到种子进行播种以获得用于表型观察的E1代突变体株系。观察发现:与对照相比,PhWRIL1基因敲除的矮牵牛转基因植株有矮化现象,叶片表面积较小,开花时间延迟。使用0.5μmol/L 6-BA对矮牵牛E1代突变体株系进行离体培养,PhWRIL1定点敲除载体E1代突变体株系外植体再生芽数和培养物质量要低于对照外植体的再生芽数和培养物质量,说明PhWRIL1定点敲除突变体再生不定芽的能力受到抑制。