RNA腺嘌呤第6位氮原子甲基化(m~6A)是核酸表观遗传修饰研究的热点。RNA中发生m~6A修饰后,可调节包括RNA剪接、核转运、RNA降解、翻译一系列下游事件,在生物体的生长、发育、疾病和应激反应等方面发挥了重要的作用。家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物,遗传背景清楚,是研究表观遗传学的良好素材。二化性家蚕子代滞育的发生与解除都受到外界信号的调控,极可能与表观遗传调控相关。本研究从RNA m~6A表观遗传修饰角度出发,研究m~6A表观修饰与家蚕滞育的关联。主要研究内容如下:在生物信息学分析家蚕m~6A甲基化工具酶基因的相关信息的基础上,q PCR和Western blot技术分析了m~6A甲基化工具酶在一化性、二化性、多化性家蚕中的转录特性和表达水平,检测了多化性不同滞育性家蚕品系相关组织中m~6A丰度的变化,分析了外界因素与m~6A甲基化修饰的关联,对二化性家蚕胚胎期不同处理组蛹期第3d卵巢进行表观转录组测序(Me RIP-seq),分析了m~6A修饰与家蚕滞育的关联。主要研究结果如下:1、家蚕中存在5种m~6A甲基化工具酶同源基因从NCBI数据库查找了部分物种的m~6A甲基化工具酶序列,采取同源比对的方式从家蚕基因组数据库中找到5个m~6A甲基化工具酶同源基因,分别为METTL3、METTL14、Fl(2)d、YTHDC1、YTHDF3。系统发育学的分析结果表明,这5个基因在不同物种中具有较高保守性。2、不同滞育性家蚕中m~6A甲基化工具酶的转录水平具有差异性采用q RT-PCR的方法分析了一化性品系安康4号(AK4)、二化性品系秋丰25℃明催青(QFHT)和17℃暗催青(QFLT)、多化性品系の海(NH)与Nistari 5个实验组家蚕从蛹期至蚕卵不同发育时期的卵巢、头部、蚕卵,m~6A甲基化工具酶的转录特性。结果显示,不同滞育性家蚕中m~6A甲基化工具酶基因的转录存在差异,特别是同一化性但滞育性不同的家蚕,基因转录的模式具有显著区别,提示家蚕的化性及滞育命运与m~6A修饰存在关联。3、不同滞育性家蚕中甲基转移酶METTL3蛋白表达具有特异性采用western-blot的方法,分析了一化性、二化性、多化性等不同滞育性家蚕蛹期不同发育时期卵巢中METTL3的蛋白表达情况。实验结果进一步确认了家蚕中METTL3的存在,而且不同滞育性家蚕中METTL3的蛋白质表达具有差异性,这种蛋白水平的变化与转录特性分析的结果具有较高一致性。4、多化性滞育与非滞育性家蚕卵巢m~6A丰度存在差异对多化性不同滞育性家蚕蛹期卵巢与蚕卵中m~6A丰度的变化用荧光免疫的方法进行了检测。结果显示,多化性有滞育和多化性无滞育家蚕在蛹期与蚕卵的不同发育时期,m~6A丰度有显著变化,多化性非滞育家蚕卵巢和蚕卵中m~6A丰度普遍高于多化性滞育家蚕,这种丰度的变化与METTL3的表达变化具有较好的一致性。5、外界因素影响家蚕m~6A修饰体系的变化采用常规即时浸酸方式处理产下后25℃18h的二化性家蚕蚕卵,使用不同浓度滞育激素处理家蚕Bm N细胞,分别从个体与细胞水平分析了家蚕滞育关联性环境因素对家蚕m~6A修饰体系的影响。结果表明,环境因素显著改变了家蚕m~6A甲基化工具酶的表达及m~6A丰度。6、RNAi和Trim-Away可显著敲降METTL3分别使用RNAi与Trim-away的方法,结合显微注射技术,对蚕卵注射ds RNA,或注射外源抗体与泛素蛋白酶系统,靶向沉默METTL3的表达。结果表明,RNAi可在转录水平显著抑制METTL3的表达,Trim-away可在蛋白水平快速消减METTL3的存在。7、不同滞育性的二化性家蚕蛹期3天卵巢表观转录组存在显著差异对二化性QFHT组和QFLT组家蚕蛹期3d卵巢进行Me RIP-seq。结果表明,两组家蚕的表观转录组存在显著差异,相比QFLT,子代滞育命运的QFHT中发生了更多m~6A事件,这种差异不仅体现在修饰基因的数量、种类与功能,而且体现在基因位点修饰频率上,进一步表明m~6A修饰深度参与了家蚕滞育这一可塑性表型的塑造。上述结果证实,家蚕的滞育性与m~6A表观修饰密切相关,环境因素的滞育信号可能通过对m~6A修饰系统的作用进一步影响滞育关联基因的表达,引起家蚕滞育性的改变。研究结果为从m~6A表观遗传层面进一步阐释家蚕滞育机制奠定了基础。