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将截短的鸡传染性支气管炎病毒S1基因在干酪乳杆菌中表达,经黏膜途径免疫鸡,诱导机体产生全身系统的免疫应答及局部的黏膜免疫。通过RT-PCR方法扩增IBV S1目的基因片段并连接在pQE-30载体上,表达并纯化蛋白;将S1基因片段构建在穿梭质粒pLA上转化到大肠杆菌表达系统,鉴定正确后,提取质粒电转化到干酪乳杆菌中,所得的重组菌菌株命名为pLA-IBV S1/L.casei。Western blot检测重组菌表达目的蛋白S1,得到约60kDa的融合蛋白,与预期结果相符,说明S1蛋白可以与抗IBV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。间接免疫荧光显示重组pLA-S1/L.casei在荧光显微镜下可见绿色荧光,表明重组干酪乳杆菌表达了外源目的蛋白。流式细胞仪可以检测出重组干酪乳杆菌菌体发光,重组干酪乳杆菌表达IBV S1蛋白表达率为86.88%。激光共聚焦可以检测到菌体在荧光显微镜下发光,明视野与绿色荧光Merge显示,是在菌体表面发光,激光共聚焦结果显示外源蛋白能够在干酪乳杆菌表面展示。为了确定重组pLA-S1/L.casei的免疫原性,应用获得的重组干酪乳杆菌经口服和滴鼻点眼两种途径进行免疫鸡并设对照组,通过间接ELISA检测,口服pLA-S1/L.casei组血清中IgG抗体水平高于滴鼻/点眼组,间接ELISA检测小肠洗液中sIgA效价,口服pLA-S1/L.casei抗体效价高于滴鼻/点眼pLA-S1/L.casei组,口服pLA-S1/L.casei组的攻毒保护力也高于滴鼻/点眼pLA-S1/L.casei组,综合以上结果确定重组pLA-S1/L.casei的最佳免疫途径为口服免疫;为了确定该重组干酪乳杆菌的最佳免疫次数和免疫剂量,间接ELISA检测,结果显示一次免疫组血清中IgG的特异性抗体水平和小肠冲洗液sIgA水平显著低于二、三次免疫组(P<0.01),但两次免疫组之间没有差异(P>0.05),5×10~8 CFU/mL组抗体水平低于5×10~9 CFU/m L、5×10~100 CFU/mL两组(P<0.01),两组之间没有显著差异(P>0.05),最佳免疫次数为二次免疫,最适免疫剂量为5×10~9 CFU/mL,淋巴细胞增值试验发现免疫重组pLA-S1/L.casei组在刺激7 d后发生脾淋巴细胞增殖pLA-S1/L.casei口服免疫组的刺激指数高于其他免疫组,且攻毒保护力也和阳性对照组(H120活疫苗组)相当,但是安全性更好。上述结果表明,IBV S1蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面,重组pLA-S1/L.casei免疫鸡后能够产生免疫应答,能够抵抗IBV的感染。