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水稻是我国重要的粮食作物,其花器官既是繁殖器官,也是水稻籽粒形成的基础,花器官的发育是影响水稻产量和品质的关键。PcG(polycomb group)类基因EMBRYONIC FLOWER2b(OsEMF2b)对水稻花器官发育非常重要,其对于植物开花时间、花器官形态、种子发育以及胁迫响应的调控机制等已有相关研究,但是对于OsEMF2b参与雄性生殖器官花药和花粉发育的调控机制研究目前还没有。本研究中,我们鉴定了一个花器官发育缺陷OsEMF2b T-DNA插入的弱突变体osemf2b-4,利用半薄切片、原位杂交、亚细胞定位以及RT-qPCR等方法,研究了OsEMF2b在水稻花药发育中的生物学功能,揭示了OsEMF2b在减数分裂后的花药和花粉发育过程中起着至关重要的作用,主要研究结果如下:
(1)对获得的OsEMF2b基因T-DNA插入突变体osemf2b-4进行检测和共分离分析,结果显示在OsEMF2b基因的启动子区域有200bp的插入,其突变表型与T-DNA插入位点共分离,将融合有水稻ACTIN启动子(强启动子)和OsEMF2b编码序列的双元表达载体,转化突变体osemf2b-4,进行互补实验的结果显示,OsEMF2b的表达量得到成功恢复的阳性植株表现出正常的花药发育和花粉,表明突变体osemf2b-4的表型确实是由OsEMF2b基因的功能减弱引起。
(2)与野生型相比,突变体的株高略矮,其花器官出现不同程度的发育缺陷,花粉育性出现不同程度的降低,其中轻微缺陷分为:颖壳变小,喙状颖壳,颖壳开裂和外稃过长等,分别占比为34.5%,34.5%,13.8%和6.9%;严重缺陷类型包括双护颖3.4%,颖壳卷曲3.4%,内稃或外稃缺失2%,和叶状颖花1.4%。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测发现,OsEMF2b基因在突变体osemf2b-4的颖花和叶片中表达量显著降低。通过对突变体osemf2b-4在不同花粉发育时期的花药进行切片观察发现,突变体表现为多种类型的发育缺陷,如绒毡层膨大或延迟降解,中间层缺失等,最终造成不同程度的育性缺陷。
(3)原位杂交结果显示,OsEMF2b基因在减数分裂期的绒毡层和小孢子,以及在小孢子时期的绒毡层中均有高表达;水稻原生质体中亚细胞定位结果显示OsEMF2b定位于细胞核内。
(4)对参与花药或花粉发育的15个核定位基因在突变体osemf2b-4中进行了RT-qPCR检测,发现包括GAMYB在内的14个基因在突变体中均被上调,只有PTC1的表达量在突变体中降低,表明OsEMF2b可能通过调控这些基因的表达参与水稻花药和花粉的发育。
(1)对获得的OsEMF2b基因T-DNA插入突变体osemf2b-4进行检测和共分离分析,结果显示在OsEMF2b基因的启动子区域有200bp的插入,其突变表型与T-DNA插入位点共分离,将融合有水稻ACTIN启动子(强启动子)和OsEMF2b编码序列的双元表达载体,转化突变体osemf2b-4,进行互补实验的结果显示,OsEMF2b的表达量得到成功恢复的阳性植株表现出正常的花药发育和花粉,表明突变体osemf2b-4的表型确实是由OsEMF2b基因的功能减弱引起。
(2)与野生型相比,突变体的株高略矮,其花器官出现不同程度的发育缺陷,花粉育性出现不同程度的降低,其中轻微缺陷分为:颖壳变小,喙状颖壳,颖壳开裂和外稃过长等,分别占比为34.5%,34.5%,13.8%和6.9%;严重缺陷类型包括双护颖3.4%,颖壳卷曲3.4%,内稃或外稃缺失2%,和叶状颖花1.4%。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测发现,OsEMF2b基因在突变体osemf2b-4的颖花和叶片中表达量显著降低。通过对突变体osemf2b-4在不同花粉发育时期的花药进行切片观察发现,突变体表现为多种类型的发育缺陷,如绒毡层膨大或延迟降解,中间层缺失等,最终造成不同程度的育性缺陷。
(3)原位杂交结果显示,OsEMF2b基因在减数分裂期的绒毡层和小孢子,以及在小孢子时期的绒毡层中均有高表达;水稻原生质体中亚细胞定位结果显示OsEMF2b定位于细胞核内。
(4)对参与花药或花粉发育的15个核定位基因在突变体osemf2b-4中进行了RT-qPCR检测,发现包括GAMYB在内的14个基因在突变体中均被上调,只有PTC1的表达量在突变体中降低,表明OsEMF2b可能通过调控这些基因的表达参与水稻花药和花粉的发育。