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目的:建立小鼠肺部cGVHD模型,探讨PD-L1在小鼠肺部慢性GVHD中的预防作用和机制探讨。方法1、小鼠:C57BL/6(H2b),B10.BR(H2k)和BALB/C小鼠购买于美国国家肿瘤研究所(National Cancer Institute,NCI)。小鼠饲养均在在无菌的动物房。2、体外试验:采用大肠杆菌扩增B7H1-fc表达质粒,后转染真核CHO细胞,分离纯化后,进行Westernblot鉴定PD-L1 Ig融合蛋白。通过分子排阻色谱(size exclusion chromatography)和结合试验(Binding assay)确定纯化的蛋白活性和功能。分离纯化小鼠脾CD4+T细胞,CD8+T细胞。利用PD-L1 Ig进行体外增殖和凋亡试验。流式细胞法检测Annexin V以及Foxp3+T细胞的变化。3、构建供者C57BL/6移植到B10.BR小鼠的肺部慢性GVHD移植模型,受体小鼠在移植前八小时,给予致死剂量的Cs137全身照射(750 cGy TBI),-3d,-2 d给予环磷酰胺120mg/kg I.P.,输注T细胞清除的供体骨髓细胞(T cell depleted BM,TCD-BM)(5×106)+脾细胞(0.25-2.0 ×106)。观察移植后的受体脱毛,腹泻,体重下降,生存,蛋白尿等GVHD指标。通过Flexivent system(SCIREQ)仪器检测移植后小鼠肺功能变化,以及唾液腺、皮肤、肺脏、肝脏的组织病理鉴定。4、确立诱导肺部cGVHD的小鼠移植模型进行体内试验,实验组注射纯化的PD-L1 Ig,对照组采用Rat Ig,剂量为400ug腹腔内注射(从移植-1天开始到+5天每天脉注射,后每周注射3次直至+28天)。观察生存,蛋白尿等GVHD指标。收集小鼠的脾脏,外周淋巴结,胸腺,皮肤,肝脏和肺脏对其淋巴细胞进行分析。1)取受者脾脏和靶器官单核细胞进行H2b、CD4、CD8、Annexin V、BrdU等染色。观察器官组织中Tcon(conventional T cells)以及Th1,Th2和Th17细胞情况数量和比例。观察组织浸润T细胞的增殖凋亡情况以及CD4+Foxp3+T细胞表达情况。以及检测供体T细胞PD-1,Tim-3以及IL7Ra等T细胞衰竭指标。2)采用Flexivent system仪监测对比小鼠移植后肺部功能变化和转归。3)小鼠腹腔注射BCL/Luc+白血病细胞,采用BLI检测肿瘤细胞扩增,观察PD-L1对GVL效应的影响。5、统计学分析:所有的数据用GraphPad软件分析(GraphPad Software).不同组临床GVHD评分和生存的比较用秩和检验或者log-rank检验。两个均数的比较用t检验。P值<0.05被认为有明显统计学意义。结果1、体外实验显示:PD-L1 Ig能明显抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖。PD-L1 Ig对CD4+T细胞凋亡无明显影响;而对CD8+T细胞,PD-L1 Ig组凋亡受到抑制明显。同时PD-L1 Ig能诱导Foxp3+T细胞的增殖。2、我们的课题成功地建立了稳定的C57BL/6 to B10.BR的小鼠肺部cGVHD移植模型。TCD-BM 5 ×106+脾细胞(0.75-1.0×106)组小鼠40天左右开始出现皮肤,唾液腺及肝脏以及肺部的慢性GVHD损害表现。Masson三色染色提示细支气管周围出现典型的胶原纤维沉积表现。通过肺功能检测结果提示GVHD小鼠气道阻力和弹性明显增加而顺应性明显减低。与TCD-BM组相比,TCD-BM+SPL0.75× 106组CD4+CD8+双阳性胸腺细胞的比例和产量明显降低。而脾脏生发中心免疫荧光显示TCD-BM+SPL0.75×106/1.0×106组受体的GC发生严重的破坏。3、PD-L1 Ig能通过多重免疫途径减轻cGVHD的发生和严重程度。1)PD-L1 Ig注射组小鼠和Control Ig相比获得更好生存。且PD-L1 Ig注射组小鼠靶组织cGVHD严重程度明显低于对照组受体。2)在皮肤组织,PD-L1 Ig注射组IL-17,IL-4表达水平接近对照组。但IFN-γ+CD4+T,IL-17+CD4+T,IL-4+CD4+T细胞的产量较对照组明显减少。而对于肺组织,PD-L1 Ig注射组供体T细胞IFN-γ和IL-17的表达水平和产量均明显减低。3)与对照组相比,移植后40天和60天,PD-L1 Ig注射组供者CD4+T细胞产量在淋巴组织中相对增多,而在皮肤和肺部的cGVHD靶组织明显减少。但肺部组织中的趋化因子和PLN中CD4+T趋化因子受体的表达两组无明显差别。4)移植后60天,PD-L1 Ig注射组受鼠脾脏和肺部组织中供体Tcon细胞的扩增受到明显抑制,而细胞凋亡无明显影响。而在肝脏中Tcon细胞的增殖和凋亡均无影响。5)移植后40天和60天,PD-L1 Ig注射组供者CD4+T细胞Tim-3的表达水平和对照组没有明显差异。但PD-L1 Ig注射组供者CD4+T细胞IL7Rα的表达水平明显降低而PD 1的表达水平明显高于对照组。6)移植后60天,PD-L1 Ig注射组受鼠的脾脏,肺脏和皮肤组织中供者Foxp3+CD4+T细胞的产量大概为对照组小鼠的2倍以上,而肝脏组织中两组无明显差别。4、小鼠BCL/Luc+白血病移植模型结果显示PD-L1 Ig注射组和对照组相比,肿瘤细胞同样在20天内被清除,且长期存活至80天。PD-L1Ig在减轻cGVHD同时保留GVL效应。结论1、采用供者C57BL/6小鼠TCD-BM联合低剂量脾细胞输注,受者B10.BR小鼠接受TBI+CTX预处理的移植模型能稳定诱导肺部cGVHD产生。2、移植早期应用PD-L1 Ig能减低Th1和Th17细胞在靶器官组织中的增殖。3、PD-L1 Ig能诱导Foxp3+CD4+T细胞在肺组织中的扩增,从而减轻肺cGVHD。