[研究背景]膜性肾病（Membranous Nephropathy,MN）是成人肾病综合征最常见的病理类型,其典型的病理表现为肾小球上皮下基底膜外侧免疫复合物沉积伴有基底膜增厚。约75%的患者为特发性膜性肾病（Idiopathic Membranous Nephropathy,IMN）,目前发现的靶抗原包括磷脂酶A2受体（Phospholipase A2 Receptor,PLA2R）和、1 型血小板反应蛋白 7A（Thrombospondin type-1 domain-containing 7A,THSD7 A）以及神经表皮生长因子样蛋白-1（nerual epidermal growth factor-like 1 protein,NELL-1）。鉴于 MN 的临床表现、治疗反应及预后均具有较大异质性,因而对其发病机制的研究尤显重要。近来研究表明,大约70%IMN患者外周血中可检测到特异性抗足细胞靶抗原PLA2R相关抗体,而且外周血抗PLA2R抗体水平与IMN患者蛋白尿缓解密切相关。国内外研究发现肾组织洗脱液中可检测到抗PLA2R抗体,而且该抗体与足细胞上PLA2R共定位。另有证据表明外周血中抗PLA2R抗体水平的升高先于蛋白尿复发,其下降先于蛋白尿缓解,同时有研究发现接受肾移植患者血清中抗PLA2R抗体阳性者更易复发膜性肾病,以上研究背景提示抗PLA2R抗体可能参与了IMN发病的发生与发展,但是其对足细胞的致病效应并不清楚。研发发现大约70%以上IMN患者肾组织局部有补体C3沉积,并且与抗PLA2R抗体存在共定位现象,提示补体系统的活化参与膜性肾病肾损伤。最早在被动海曼肾炎（Passive Heymann Nephritis,PHN）大鼠模型中已观察到肾脏上皮下可看到免疫复合物沉积,局部补体系统活化所导致的足细胞损伤,包括足细胞骨架重组、裂隙膜丢失及大量蛋白尿的出现。虽然其后证实该模型中足细胞原位抗原为meglin蛋白,但补体系统在其足细胞损伤中的作用仍值得关注。补体系统途径包括经典途径、旁路途径及甘露糖结合凝集素途径（Mannose-binding lectin pathway,MBL）。需要指出的是大约有90%以上MN患者肾小球上皮下可见C4d沉积。C4d是补体经典途径或者MBL途径活化时裂解C4的产物,提示MN中经典途径或MBL途径可能参与局部肾组织损伤。另外,大部分研究均发现,MN患者肾组织鲜有C1q沉积,进一步提示补体MBL途径活化在IMN患者肾组织损伤中起到关键作用。近年来研究发现,IMN患者IgG4型抗PLA2R抗体N-糖基化末端存在N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）与半乳糖（Galactose,Gal）比例异常,提示了该抗体分子存在N-糖基修饰异常的可能。有意思的是,目前在IgA肾病的研究中发现血清中半乳糖缺失的IgA1分子可通过激活MBL途径导致系膜细胞损伤。而且来自类风湿性关节炎患者的研究发现:IgG1型类风湿因子N-糖基化末端半乳糖修饰缺失导致N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-glucosamine,GlcNAc）暴露,后者可通过MBL途径激活补体加重疾病损伤。以上研究提示了抗PLA2R抗体与MBL途径存在交互作用可能。因而研究二者间相互作用亦尤显必要。需要指出的是鉴于PLA2R特异性表达于哺乳类动物,目前尚无PLA2R相关IMN特异性动物模型。而足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分。足细胞损伤是肾小球滤过屏障障碍并蛋白尿生成的重要的原因,主要表现为足细胞足突融合,细胞骨架重组及细胞凋亡。因而利用体外足细胞培养体系来探究抗PLA2R抗体的致病性及其与MBL途径间的相互作用尤为重要。本研究旨在探讨抗PLA2R抗体、MBL途径在IMN发病机制中的作用,以期发现潜在的临床治疗靶点。[研究目的]1.探讨MBL在IMN患者肾小球的表达情况,及其与病情严重程度及治疗反应、临床预后的关系。2.探讨IMN患者来源含Anti-PLA2R抗体对人足细胞的损伤效应。3.探讨IMN患者来源Anti-PLA2R抗体与MBL协同致人足细胞损伤效应。[研究方法]1.利用IMN随访队列人群基线肾组织,运用免疫荧光检测肾组织MBL anti-PLA2R抗体沉积情况。2.利用IMN随访队列人群基线血清,应用ELISA试剂盒检测血清中Anti-PLA2R、anti-THSD7A、血清MBL。3.利用纯化的IMN来源的含Anti-PLA2R IgG抗体刺激足细胞,观察足细胞固有蛋白的表达情况、细胞上清炎症因子水平、细胞骨架紊乱情况以及细胞凋亡情况。4.利用纯化的IMN来源的含Anti-PLA2R IgG抗体、MBL成分共刺激足细胞,进一步观察足细胞胞膜补体活化情况、固有蛋白的表达情况、细胞骨架紊乱情况以及细胞凋亡情况。[研究结果]1.79.1%（53/67）IMN患者肾组织MBL免疫荧光染色为阳性,且MBL与抗PLA2R抗体共定位。组织MBL阳性组及MBL阴性组中,组织抗PLA2R抗体染色阳性率及血清抗PLA2R抗体阳性率无统计学差别。血清肌酐矫正后的血清MBL浓度中位数分别为4.92（IQR,0.86,8.90）和2.28（IQR,0.4,5.62）,两组间没有统计学差别。同样,两组间在血清白蛋白水平（26.5±6.6和28.6±6.1g/L）、eGFR水平（104.8±17.4和 114.6±16.1ml/min.1.73m2）、尿蛋白定量水平（5.35和4.25g/d）及其他临床指标都没有发现显著的统计学差别。根据参考文献,我们定义ICR（Incomplete remission ICR）1为尿蛋白定量介于0.3-1.0g/d之间,ICR2为尿蛋白定量在1.0-3.5g/d之间,或者尿蛋白定量下降至基线的一半以下。完全缓解（Complete remission,CR）:尿蛋白定量<0.3g/d。肾功能异常定义为eGFR较基线值下降30%。研究中,我们定义蛋白尿缓解和肾功能异常为临床事件。在单因素COX回归分析中,我们发现MBL组织沉积是ICR1的保护性因素(（HR,2.78;95%CI:1.07-7.19;P=0.035）,经过矫正性别、年龄、血清抗PLA2R抗体浓度、基线eGFR、治疗方案、收缩压之后,多因素COX回归结果仍提示MBL沉积对ICR1有保护性作用（HR,6.31;95%CI:1.10-36.14;P=0.039）。但是MBL组织沉积对于CR（HR:8.00,95%CI:0.65,98.23;P=0.10）及肾功能预后（HR,0.48;95%CI:0.16-1.40;P=0.18）无意义。提示IMN基线时刻肾组织MBL沉积者容易达到蛋白尿部分缓解。2.利用蛋白亲和层析柱纯化含Anti-PLA2RIgG抗体,进而构建足细胞培养体系。设立IMN患者含Anti-PLA2RIgG（IMNIgG）刺激组、健康人IgG刺激组（Normal IgG）和Control组分别刺激足细胞,我们发现与Normal IgG组相比,IMN IgG刺激组足细胞podocin蛋白表达下降（P=0.016）,足细胞podocinmRNA表达下降（P=0.005）,足细胞表面podocin蛋白荧光表达减弱,细胞骨架紊乱重组,足细胞凋亡增多（P=0.008）,提示抗PLA2R抗体对足细胞的损伤效应。3.为了进一步明确Anti-PLA2R抗体与MBL是否存在交互作用加重损伤足细胞,我们构建了含anti-PLA2RIgG抗体与MBL共刺激组、健康人IgG与MBL共刺激组、含Anti-PLA2R IgG抗体单刺激组、MBL单刺激组来探索二者间的相互作用。研究发现,较含Anti-PLA2R抗体单刺激组及健康人IgG与MBL共刺激组相比,含Anti-PLA2R抗体与MBL共刺激组足细胞上C5b-9表达多,足细胞podocin蛋白（P=0.002,P=0.002）及mRNA（P=0.019,P=0.032）表达更低,足细胞细胞结构更紊乱,足细胞凋亡更多,提示抗PLA2R抗体可能通过MBL途径发挥足细胞致病效应。[研究结论]1.IMN肾组织MBL沉积比较常见,且与抗PLA2R抗体共定位,其沉积情况可能与IMN蛋白尿缓解相关。2.IMN含Anti-PLA2RIgG抗体对足细胞具有损伤效应,且其与补体MBL存在协同作用共同参与足细胞损伤。[创新性]1.本研究在国人IMN患者中证实了肾组织MBL高度参与疾病的进展。2.本研究利用IMN患者来源含anti-PLA2R IgG抗体对足细胞的致病性进行了探索。3.本研究从细胞水平证实IMN患者来源含anti-PLA2R IgG与MBL协同致足细胞损伤。[不足之处]1.临床研究部分为单中心回顾性分析,纳入IMN随访样本偏少,随访时间相对偏短。2.鉴于目前无IMN疾病模型,未能开展动物实验进行体内验证。